Обратное сшивание в ChIP-seq

Иммунопреципитация хроматина (ChIP) представляет собой тип экспериментального метода иммунопреципитации, используемого для исследования взаимодействия между белками и ДНК в клетке. Краткое изложение протокола для ChIP здесь . Вкратце шаги таковы:

  1. ДНК и связанные с ней белки на хроматине в живых клетках или тканях сшиты;
  2. Комплексы ДНК-белок расщепляются на фрагменты ДНК ~ 500 п.н. путем обработки ультразвуком или расщепления нуклеазами;
  3. Фрагменты поперечно-сшитой ДНК, связанные с интересующим(и) белком(ами), селективно иммунопреципитируют из клеточного дебриса с использованием соответствующего специфичного к белку антитела;
  4. Ассоциированные фрагменты ДНК очищают и определяют их последовательность.

Насколько я понимаю, после шага 3 (иммунопреципитация комплекса белок-ДНК) перекрестная связь белок-ДНК меняется на противоположную, и белки удаляются путем расщепления протеиназой К.

Может ли кто-нибудь сказать мне, включается ли на этом этапе ДНК в месте сшивания в дальнейший этап секвенирования или вымывается вместе с самим белком?

Добро пожаловать в Biology.SE! Я немного подправил вопрос - надеюсь, правки в порядке.
Итак, вы хотите знать, теряется ли ДНК на этапе реверсирования перекрестных связей?
Да. Точнее, в месте, где соединяются белок и ДНК.

Ответы (1)

После этапа реверсирования сшивания у вас все еще есть ДНК, связанная с фрагментами белка.

Таким образом, на этом этапе вместо обычной очистки ДНК нам также необходимо использовать фенол-хлороформную экстракцию или специальные колонки для отделения ДНК от белковых фрагментов.

Термофишер обычно дает действительно хорошие объяснения .

Пожалуйста, дайте мне знать, если я не правильно понял вопрос! :)

Обратное сшивание в ChIP-seq
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v