Я дважды размораживал клетки Hl-60 из камеры с жидким азотом в среде RPMI 1640 (содержащей 10% FBS, L-глутамин, пенициллин/стрептомицин). В первый день клетки остаются в порядке. Но при пересеве из первого флакона в новые флаконы (клеточный раствор : среда = 1:3) все флаконы контаминировались на 2-й день культивирования. Облако было найдено в оба раза. Можно отметить, что для выращивания я использовал стерильные одноразовые пипетки и колбу без покрытия. Все переносы в другие колбы и добавление сред были выполнены очень осторожно и внутри чистого стенда. Перед использованием чистого стенда его опрыскивали 70% EtOH.
Кто-нибудь сталкивался с подобной проблемой? Пожалуйста, поделитесь и, если есть, дайте несколько ценных предложений или ссылок.
Спасибо
Единственная наиболее вероятная причина загрязнения заключается в том, что ваш замороженный запас заражен. Предполагая, что вы должным образом обучены работе с клеточными культурами, вы работаете в правильно обслуживаемом боксе биобезопасности, все ваши реагенты стерильны (была ли ваша среда стерильно отфильтрована после добавления FBS и т. д.?), а инкубатор чист. (поддон с водяной баней был автоклавирован, в него была добавлена стерильная вода с биоцидом/фунгицидом, весь инкубатор протирался, а все съемные части периодически автоклавировались и т. д.), тогда наиболее разумным ответом является загрязнение запасов. Попробуйте разморозить более ранние пассажи, чем те, с которыми вы работали, или закажите новый флакон или два в ATCC или у любого поставщика ваших клеток. Убедитесь, что ваши пипетки чистые и что вы используете стерильные наконечники с фильтрами.
Не пропускайте руки через отверстия колб/пробирок, так как бактерии кожного происхождения являются основным источником заражения. Безопасно кратковременно поджечь крышки и отверстия пробирок перед открытием или укупоркой. Если вы придерживались хороших асептических методов при оттаивании и пересевах, возможно, замороженные клетки ранее были заражены. Попробуйте разморозить новый флакон с замороженными клетками и посмотрите, есть ли улучшения.
Есть простая причина такой «мутности» культур. HL-60 представляет собой суспензионную клеточную линию (см. ATCC ), поэтому большинство клеток остаются в жидкой фазе и не прилипают к пластиковой поверхности культурального флакона. Некоторые могут, но обычно они не очень хорошо прилипают и отрываются при перемещении колбы или легком постукивании по ней.
Суспензионные культуры выглядят иначе, чем бактериальные загрязнения, они менее плотные, и вы можете увидеть клетки (которые намного крупнее бактерий) в микроскоп, когда смотрите на культуру. Бактериальные культуры часто создают отложения бактерий на границе среды. А среды бактериальных контаминированных культур почти всегда имеют желтый цвет, так как продукты метаболизма делают среду кислой. Здесь не помешало бы изображение.
М Рахман
Крис
М Рахман