Вектор AcGFP1 может излучать свет сам по себе, тогда как в случае вектора Luc для реакции необходим субстрат. Тем не менее, Luc считается более специфичным или лучшим, чем AcGFP1. Почему это так называется? Каковы преимущества векторов Luc по сравнению с AcGFP1?
Вы путаете люминесценцию и флуоресценцию. GFP не излучает свет. Аббревиатура расшифровывается как Green Fluorescent Protein. Вам нужно посветить на него синим источником света, и он будет флуоресцировать зеленым. Проблема в том, что многие организмы имеют фоновую флуоресценцию, клетка без какого-либо GFP часто может иметь небольшую флуоресценцию сама по себе или содержать пигменты, маскирующие сигнал.
Анализы люциферазы зависят от химической реакции, которая окисляет молекулу (люциферин в случае люциферазы светлячка) и испускает фотоны. Это намного более чувствительно, чем флуоресценция, но также намного дороже и обычно (но не всегда) требует лизиса клеток. Ячейка очень редко излучает свет сама по себе, поэтому фон будет намного ниже, что позволит вам увидеть меньшую разницу.
Есть много причин, чтобы выбрать один из них в анализе, если вы расскажете немного больше о том, как вы собираетесь использовать репортер, вы можете получить более подробный ответ.
Используемый вектор будет зависеть от того, что вы хотите сделать.
Возможные проблемы с GFP:
Потеря функции слитого белка (вы добавляете 238 аминокислот к вашему белку, это довольно большое изменение!). Существуют векторы, позволяющие слиться с C- или N-территорией вашего белка, чтобы избежать этого.
GFP может отделяться от своего слитого белка, что делает бесполезными наблюдения или иммунопреципитацию.
При использовании вектора с высокой экспрессией у вас может быть насыщение флуоресценции в ваших клетках, поэтому количественная оценка будет затруднена.
При анализе люциферазы вы добавляете субстрат, чтобы ваши количественные оценки могли быть сделаны, как только начнется реакция, а люминометры достаточно чувствительны, чтобы обнаруживать очень низкую активность Luc или использовать очень мало клеток.
НО
Векторы GFP позволяют проводить анализы in vivo (количественная оценка, внутриклеточная локализация, сортировка клеток...), в то время как для анализа Luc требуется лизис ваших клеток. Таким образом, в зависимости от вашей цели будет лучше использовать ту или иную систему.