Влияет ли pH на константу Михаэлиса?

Я пытался подтвердить Км субстрата (что составляет 34 +/- 4 мМ). Это значение было получено в 50 мМ MOPS, pH 6,3. Я провел свой кинетический анализ в буфере с pH 7 и получил значение Km в 21,5. Согласно этой статье , рис. 2C, нормализованная удельная активность фермента составляет около 70 % при pH 6,3 и около 47 % при pH 7. Если я разделю 34 мМ при pH 6,3 на 0,7 (что должно дать мне оптимальную Km при оптимальный рН 5,5) и потом умножаю на 0,48, тогда получаю 23 мМ. Однако в документе говорится, что Km составляет от 30 до 38 мМ, поэтому, если я разделю 30 и 38 по отдельности на 0,7 и умножу на 0,47, я получу 20 и 25,6 мМ соответственно. Поскольку мое значение попадает в этот диапазон, это должно означать, что у меня правильный фермент и тот же результат, что и на бумаге.

Итак, мои вопросы:

  1. Когда в документе говорится, что Km составляет «34 +/- 4 мМ», могу ли я предположить, что это означает, что Km может быть где-то между 30–38 мМ? Я удивлен, увидев, насколько широк диапазон. Я предположил, что Km обычно представляет собой одно значение с отклонением не более 0,1.

  2. Изменяет ли pH значения Km? Я понимаю, что рН изменяет форму(ы) фермента и/или субстрата. Следовательно, это должно повлиять на то, насколько он хочет связать с субстратом. Если желание фермента связываться с субстратом уменьшается, например, из-за увеличения pH, это будет означать, что для окружения фермента требуется больше субстратов, что увеличивает Km.

  3. Если pH действительно изменяет Km, то как я определяю значение Km для другого значения pH, если значение Km для другого значения pH уже известно? Я знаю, что удельная активность и константа Михаэлиса различны, но сколько продукта может быть преобразовано в минуту, зависит от того, насколько фермент любит связываться с субстратом, что представлено константой Михаэлиса. Пришли ли мои рассуждения и расчеты к правильному выводу? Если нет, то как производится расчет?

Очень краткий ответ: да, уровень pH почти всегда влияет на эффективность ферментов. Примером являются лизосомальные ферменты, которые оптимально активны в кислой среде лизосомы, но неэффективны при близком к нейтральному рН цитозоля. Это защищает клетку в случае разрыва лизосомы; ферменты не будут переваривать саму клетку. Из статьи в Википедии «Значение K_\mathrm{M} зависит как от фермента, так и от субстрата, а также от таких условий, как температура и pH». . И постарайтесь не забыть Мод Ментен.
Спасибо за ваш ответ. Но есть ли уравнение или метод для расчета отношения между Km и pH? Если нет, был ли мой расчет верным? Я хочу убедиться, что если pH = 6,3 и Km = 34, то Km должен равняться двадцати с чем-то при pH 7.
@wswr Нет, это предположение неверно, потому что взаимосвязь между Km и pH может быть нелинейной и варьироваться между разными ферментами.
На самом деле, если подумать, я путал постоянную Михаэлиса-Ментен с удельной активностью. Мой расчет был неверным. При pH 6,3 удельная активность высока, а значение Km равно 34. Km, полученное мной при pH, равно 21,5, но, согласно статье, при pH 7 удельная активность ниже, а значит, Km должно быть выше. Можно ли предположить, что чем выше Км, тем ниже удельная активность, и наоборот?
Эта статья может вам помочь: Текущие рекомендации IUBMB по номенклатуре и кинетике ферментов.

Ответы (1)

Из вывода кинетики Михаэлиса-Ментен видно, что:

К м знак равно к ф + к с а т к р

Где к ф а также к р - константы скорости связывания и разъединения (для связывания фермент-субстрат) соответственно, и к с а т это номер оборота. Это для квазистационарного приближения (QSSA). Для равновесного приближения:

К м знак равно к ф к р
что совпадает с константой ассоциации.

В обоих случаях pH может влиять на скорость связывания и расщепления, воздействуя на сродство между ферментом и субстратом. Например, предположим, что сайт связывания субстрата заряжен отрицательно. Низкий pH увеличит электростатический потенциал места связывания субстрата до нуля, влияя на ионизацию функциональных групп.

рН также может оказывать косвенное влияние на сайт связывания субстрата, поскольку он может изменять общую структуру белка.

Многие реакции, катализируемые ферментами, включают кислотно-щелочной катализ , т.е. происходит перенос протона. В подобных реакциях pH может влиять к с а т .

Если pH действительно изменяет Km, то как я определяю значение Km для другого значения pH, если значение Km для другого значения pH уже известно?

Вы можете сделать это, построив график Лайнуивера-Берка для измененного pH.

Я сделал график Лайнуивера-Берка, чтобы получить Km 21,5 при pH 7. Но поскольку единственное значение Km, которое я могу сравнить, чтобы проверить активность фермента, находится при другом значении pH 6,3, я хочу знать, есть ли другой способ чтобы убедиться, что мой результат правильный.
@wswr Сделайте график LB для pH 6,3, а затем сравните. Если ваши измерения сделаны точно, ваш результат должен быть правильным. Результат — это то, что вы наблюдаете; так что нет вопроса о правильном или неправильном. К сожалению, простой зависимости между Km и pH не существует. Вы можете выполнить LB-анализ при разных pH и попытаться найти взаимосвязь с помощью регрессии. Но это применимо только к вашему ферменту.
Педантичным тоном «отвязывание» можно было бы идиоматически описать как диссоциацию.
Я только что заметил, разве Km = (kr + kcat)/kf = константы скорости диссоциации: константа скорости ассоциации?
@wswr kr — константа скорости диссоциации. kcat – число оборотов или константа скорости образования продукта. Оба они снижают концентрацию комплекса [ES].
Влияет ли pH на константу Михаэлиса?
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v