Ручной дизайн праймера для гена на обратной цепи

Совсем не глупый вопрос. Я был так же смущен этим, как новичок в молекулярной биологии. Вы освоитесь через какое-то время. :)

Мне гораздо труднее создавать праймеры только из одной нити, особенно минусовой, поэтому я всегда стараюсь работать с обеими. Если вам не хочется этого делать, достаточно одной нити (плюс или минус), но я бы порекомендовал по крайней мере получить обратное дополнение в вашем случае, потому что с плюсовыми нитями намного проще работать.

Для быстрого примера предположим, что у меня есть последовательность из десяти п.н., для которой я хочу разработать праймеры, и это моя плюсовая последовательность:

5' АТААКТЦГТ 3'

Теперь предположим, что мне нужен праймер из трех пар оснований. Таким образом, прямой праймер будет просто 5' ATA 3', это легко. Обратный праймер, если я просто возьму его оттуда, не переворачивая, будет 5' CGT 3'. Но если я включу это в свою реакцию ПЦР, это ничего не даст, потому что ДНК связывается со своей цепью комплемента, а это означает, что праймер будет связываться только с 3' ACG 5' или 5' GCA 3'. Поэтому вместо этого я хочу 3' ACG 5', потому что он будет связан со своим дополнением, частью 5' CGT 3' моей последовательности. (Техническая проблема здесь, поставщики обычно дают возможность писать только от 5 до 3 футов, что имеет смысл, но вы должны не забыть перевернуть обратный праймер, прежде чем отдавать его им, потому что изначально он будет от 3 до 5 футов. В этом случае я бы попросил 5' GCA 3'.)

Это легче визуализировать, если у меня есть плюсовая и минусовая нити, которые будут выглядеть так:

5' АТААКТЦГТ 3'
3' ТАТТГААГКА 5'

Если у вас есть обе нити, как в приведенном выше примере, вы можете без особого труда найти и прямой, и обратный праймер.

Я мог бы дать более исчерпывающий ответ о том, как все это работает во время репликации ДНК, который включал бы иллюстрации, аллегории и, возможно, несколько слегка юмористических шуток, но я бы не хотел утомлять вас без необходимости, поэтому дайте мне знать, если вы понимаете сейчас или если тебе нужно больше. ;)

Редактировать: Точно (к вашему третьему комментарию, я имею в виду)! Помните, что ДНК всегда читается и реплицируется от 5' до 3', поэтому прямой праймер будет связываться с минус-цепью и реплицироваться от 5' до 3', поэтому последовательность будет расширяться вправо. Обратный праймер противоположный, от 3' до 5', поэтому он удлинит плюсовую цепь влево. После того, как это произойдет, вы получите две полные нити. Как и обещал, вот иллюстрация:

Теперь к вашему вопросу о Primer-BLAST. Вам не нужно вводить плюсовую цепь, но инструмент предполагает, что вы вводите плюсовую цепь, поэтому вы получите правильные праймеры, он просто назовет их неправильными именами (т. е. в приведенном выше примере это даст вам 5' GCA 3' в качестве прямого праймера и 5' ATA 3' в качестве обратного). Прямой и обратный праймеры обрабатываются одинаково, так что это не испортит вашу ПЦР, но, тем не менее, будет неверным. Чтобы избежать путаницы, я предлагаю использовать инструмент для обратного комплимента вашей минусовой последовательности в плюс перед ее запуском. Довольно легко получить обратное дополнение любой последовательности; вот хороший инструмент для этого.

Надеюсь, это поможет. :)