Создание праймеров с сайтами рестрикции

Я хочу разработать прямой и обратный праймеры, включающие выступы с сайтами рестрикции, с ДНК, используемой для клонирования ферментов рестрикции.

Если я хочу отправить свою ДНК в компанию, занимающуюся синтезом, должен ли я включать в ДНК выступающий конец с сайтами рестрикции? Имеет ли значение, если праймеры имеют выступ ДНК в своей последовательности?

Из последовательности в самом конце, какую последовательность п.н. я бы рекомендовал использовать для своих праймеров, если я хочу прибл. 20-25бп за праймер?

См. ниже последовательность кДНК:

Место вырезания Nde1 : 5' ... CA|TATG ... '3'

Место разреза Xho1 : 3'...GAGCT|C...5'

кДНК с выступающими частями , которые имеют сайты рестрикции, Ndel1 (5'-> 3') и Xho1 (3'-> 5')

5' catatg - ATGGGTTCAAACACTTCCAAAGTGGGTGCTGGTGCAGAAAAACAACAAGTCTATACTCCG
CTAACACAGATCGATTTTTCACAGTCTTTGGTTTCTCAATTGGATTCATCGAAGGAATCA
GACTATGTCACCAAGCAAAATGCAGAAAAGTTCATTGAGAAGAAGGTTTCACAAAGGCTA
TCTAACCTAGAAGTTGAAACGTTAAAGAAGTTTGAAGATACTTTGAACAATTCACTATTA
TCAGACGACGACAAGGATGCCGTTGATGGAATATCATCAAGTTCATTGAATAATCAAATC
GAGTCGTTGAACAAGAAACTAACATTATTTGATCAATTAGAGTTACAAAAGTTGGAGAAA
TATGGGGGTGCCAAAGGTAAATCTGATAAAAAAACCGACAACGGCAGCATTTCTATAAAG
GCAAAATTGACTGAGTGTCTTTTGGCCAATAAGGGCAAGCCATTGAATTGTTACGAAGAG
ATGGAAGAATTCAAGAAGCTCGTTATGGGTTGA - gagctc 3'
Я добавил ответ, но я не совсем понимаю, что вы имеете в виду, когда говорите: > «Из последовательности в самом конце, какую последовательность п. грунтовка?" Вы спрашиваете нас, какую последовательность следует использовать для обратного праймера?
Да, я просто хотел получить представление о последовательности праймеров, или, по существу, если бы я мог просто начать (то есть включая весь выступ) праймер прямо в начале выступа.
Ваша исходная последовательность должна быть обратной комплементарностью последних ~ 20 п.н. кодирующей последовательности . Добавьте место ограничения в 5-футовом конце этого, а затем ваш выступ после этого. В итоге ваш праймер будет 20+6+3= 29 п.н.

Ответы (1)

Да.

Если вы собираетесь субклонировать фрагмент с помощью классического клонирования рестрикционных ферментов, вам нужен выступ.

Различные ферменты рестрикции требуют разной длины выступающих частей, чтобы они могли полностью расположиться на цепи, а затем расщепить последовательность.

У NEB есть отличная страница с подробным описанием того, сколько оснований необходимо для ферментов, которые они продают:

https://www.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/cleavage-close-to-the-end-of-dna-fragments

Нет, не имеет значения, появляется ли выступ в другом месте ДНК, если только ваши сайты рестрикции этого не делают (очевидно).

Вот некоторые соображения, которые я использую при разработке праймеров для ПЦР (хотя и не совсем применимые, если вы просто синтезируете их):

  • Используйте 3+ пары оснований, представляющие заданное количество нуклеотидов в вашем сайте рестрикции в последовательности, из которой вы проводите ПЦР, в качестве выступающей последовательности, чтобы позволить связать еще несколько оснований. то есть

    Со следующей грунтовкой:

    Выступ — сайт рестрикции — последовательность прайминга

    AAA-GGATCC-ATGACATGCAGTAGC PRIMER

    ||| |||||||||||||||

    TTT--------TACTGTACGTCATCG TARGET SEQUENCE

  • В качестве альтернативы я использую эти 3 или около того пар оснований для добавления или удаления содержания GC и манипулирования Tm, если температуры отжига двух праймеров не совпадают идеально.

Спасибо, это имеет смысл, но если рестрикционные ферменты, которые я использую, обрежут выступы, они также оставят несколько пар оснований выше и ниже фактического гена, вызовет ли это проблемы с кадрированием или не имеет значения, где вставлен GOI в плазмиде MCS?
Чтобы исправить кадрирование, вы должны / можете добавить базы между сайтом рестрикции и интересующим фрагментом. Но так как ваш NdeI ATG находится в кадре с start-ATG, я не ожидаю никаких проблем. Вы даже можете удалить один из этих ATG, если хотите.
Итак, мне следует удалить TATG из 5'... CA|TATG... '3' (Nde1) и C из 3'...GAGCT|C...5' (Xho1)? Если я добавлю основания, это не приведет к тупым концам?
Единственное, что меня беспокоит, это пространство, которое оставшиеся пары оснований создают вверх по течению, не совсем уверен, повлияет ли это на перевод.
Нависание исчезнет при переваривании ферментами рестрикции. единственная последовательность, которая будет сохраняться, — это сайты рестрикции, которые позволяют беспрепятственно встраиваться в ваш вектор. Дополнительные основания сайтов рестрикции не могут быть переведены, так как они будут находиться перед вашим стартовым кодоном и после стоп-кодона. Если это не имеет для вас смысла, я бы посоветовал прочитать основы клонирования в Sambrook et al или другом хорошем учебнике.
Базы будут иметь значение, если вы хотите клонировать что-то в кадре с помощью тега / слитого белка или чего-то подобного. Также изменение пространства между RBS и стартовым кодоном может немного изменить экспрессию.
Создание праймеров с сайтами рестрикции
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 6v