ПЦР дальнего действия с использованием NEB Master Mix - Hot Start Taq у меня работал нормально (размер ампликона ~ 10 КБ), но внезапно перестал работать. Возможно ли, что многие циклы замораживания-оттаивания на матрице ДНК вводят зазубрины в цепь ДНК, которые препятствуют полимеразной активности? В некоторых случаях я не получаю усиления, а в некоторых получаю очень слабое усиление. Поскольку целостность ДНК должна быть неповрежденной по всей длине в случае ПЦР дальнего действия, прав ли я, полагая, что разрывы в ДНК будут особенно вредны, если мы пытаемся амплифицировать большие фрагменты?
Концентрация матриц ДНК, которые я использовал, составляла 90-140 нг/мкл в 10 мкл реакции ПЦР, ДНК элюировали в буфере TE после экстракции ДНК методом магнитных шариков.
Не исключено, что взлом вызывает проблемы. Вопрос в том, является ли причиной проблемы многократное замораживание и оттаивание. В журнале BRL Focus в 1983 году была опубликована статья, в которой этот эффект оспаривается. Вы можете найти PDF со статьей здесь , сама статья начинается на странице 10 в PDF. С другой стороны, есть эта статья (« Влияние длительного хранения на стабильность стандартной ДНК для методов на основе нуклеиновых кислот »), в которой показано, что условия хранения действительно влияют на эффективность стандартов количественной ПЦР. Что бы ни вызывало надрезы, это проблема (длинной) ПЦР. Следующая цитата из Sigma в их длинной смеси ферментов ПЦР:
Шаблон Высокое качество и адекватная длина шаблона необходимы для надежной амплификации больших фрагментов. Необходимо соблюдать крайнюю осторожность при подготовке ДНК-мишени для длинной ПЦР и обращении с ней. Разорванная или поврежденная ДНК может служить потенциальным сайтом прайминга, что приводит к высокому фону. Избегайте замораживания или, в качестве альтернативы, замораживайте только один раз, чтобы свести к минимуму ущерб. Состояние ДНК-мишени является критическим. Депуризация во время циклирования сводится к минимуму за счет использования буферов с рН выше 9,0 при 25 °С.
В этой статье (« Влияние высокофрагментированной ДНК на ПЦР ») показано, что индуцированные разрывы влияют на эффективность ПЦР (хотя они делают амплификацию намного короче, чем вы). Поэтому, чтобы преодолеть эту проблему, я бы сделал небольшие аликвоты свежих препаратов ДНК, а затем посмотрел, поможет ли это.