При выполнении клонирования ДНК иногда проводят ПЦР-ампликон в агарозе и обнаруживают по метке бромистым этидием в УФ-свете. После этого гель нарезают, из геля извлекают ДНК……. пока не получится ваш трансгенный организм. Дело в том, что при этом вы используете тот самый образец ДНК, который был «загрязнен» бромистым этидием, так содержит ли эта ДНК, которую вы используете для трансформации, бромистый этидий? если да, то как это может повлиять в цифрах на риск мутации?
Очищенная ДНК содержит незначительное количество бромистого этидия. Наборы для ПЦР и очистки геля удаляют его достаточно хорошо. Однако существует риск мутации из-за того, что вы визуализируете гель в ультрафиолетовом свете с бромистым этидием. Риск мутации от УФ-излучения сводится к минимуму за счет минимального воздействия на гель и использования «препаративных» трансиллюминаторов, которые поставляются с настройкой для слабого освещения для целей клонирования. Если вы работаете хорошо и быстро, вероятность мутагенеза не выше, чем вероятность того, что полимераза включит неправильный нуклеотид.
Хотя можно получить мутации от бромистого этидия, вряд ли это единственный источник мутаций в процессе. Сам Taq довольно часто вводит мутации, поэтому в процедурах, чувствительных к последовательности, обычно используется более точная (но более медленная и более дорогая) полимераза, такая как Pfu. Как указывалось ранее, УФ также может вызывать мутации. Процесс ПЦР сам по себе может привести к димерам праймеров и другим «причудливым вещам». Неподходящие последовательности могут быть обнаружены из-за загрязнения окружающей среды, особенно если вы часто используете одни и те же рестриктазы в лаборатории, потому что последовательности с соответствующими «липкими концами» будут повсюду, независимо от того, насколько тщательно вы чистите. При вставке в плазмиду несколько вставок могут быть лигированы в конечный продукт, в зависимости от того, насколько гомологичны липкие концы вставки.
Решение состоит в том, чтобы точно секвенировать конечный трансгенный продукт, прежде чем поместить его в трансгенный организм. Я обычно секвенирую плазмиду (я работаю с трансфекцией плазмид), а также вырезаю плазмидную вставку из плазмиды и запускаю ее на геле. Секвенирование улавливает любые замены/вставки оснований, а гель гарантирует наличие только одной копии вставки в этой конкретной плазмиде.
Вы будете удивлены, узнав, как часто в конечном продукте появляются мутации и прочий «мусор», поэтому важно делать несколько партий вместе. Я делаю свои партиями по 8 штук, так что по крайней мере пара будет именно тем, что я собирался произвести.
Ссылка: Мое собственное исследование/опыт сайт-направленного мутагенеза и конструирования плазмидных векторов для трансфекции.
Крис