Фагемидный дисплей

Я нашел статью в Nature:

Вспомогательный фаг для улучшения представления одноцепочечных антител в фаговом дисплее

Экспериментальный протокол

Стандартные процедуры клонирования, определение колониеобразующих единиц и бляшкообразующих единиц, а также иммуноблотинг после ПААГ проводили согласно Sambrook et al.

Строительство линии упаковочных ячеек.

DH5альфа/pIII [M13KO7DeltapIII]. Ген M13 pIII, слитый с промотором P/A1/04/03 (ссылка 17), был вставлен в сайт множественного клонирования плазмиды лямбдааттР pLDR9 (ссылка 18). Ориджин репликации и ген устойчивости к канамицину вырезали, а оставшуюся нерепликативную ДНК lambdaattP-pIII повторно лигировали. Escherichia coli DH5альфа, содержащая плазмиду pLDR8 (ссылка 18), трансформировали нерепликативной ДНК лямбдааттР-рIII и высевали на чашки с агаром, содержащие 25 мкг/мл ампициллина. После инкубации в течение ночи при 42°C полученные колонии высевали в репликах и идентифицировали устойчивые к ампициллину клоны, названные E.coli DH5alpha/pIII. Затем их трансформировали с помощью M13KO7DeltapIII, в результате чего была получена упаковочная клеточная линия E. coli DH5alpha/pIII [M13KO7DeltapIII].

Производство фага.

Для получения хелперного фага M13KO7DeltapIII ДНК M13KO7DeltapIII электротрансфицировали в E. coli K802, содержащую pNDI (ссылка 15). Для получения гиперфага ДНК M13KO7DeltapIII электротрансфицировали в E. coli DH5alpha/pIII. Фаг получали культивированием в присутствии 0,5 мМ изопропил-бета-D-тиогалактозида (IPTG) при 30°C в течение 24 ч при встряхивании при 200 об/мин. Escherichia coli Top10F' или E. coli Xl1blue, несущие фагмиду pSEXphOx(Yol) или библиотеку scFv в pSEX81, соответственно, инфицировали препаратом хелперного фага при OD600 0,1 при множественности инфицирования 20, как описано.

Количественное определение фагов методом ELISA.

Серию разведений фага покрывали 100 мМ NaHCO3, pH 8,6, в планшетах MaxiSorb ELISA (Life Technologies, Karsruhe, Germany) на 16 ч при 4°C. Блокирование проводили 2%-ным сухим обезжиренным молоком в PBS (137 мМ NaCl, 3 мМ KCl, 8 мМ Na2HPO4, 1 мМ KH2PO4, pH 7,3) в течение 2 ч при комнатной температуре. Фаг обнаруживали с помощью моноклонального мышиного антитела B62-FE2 (Progen, Гейдельберг, Германия), специфически связывающего эпитоп на основном белке оболочки pVIII фага М13. Для стандартизации использовали фаг М13КО7 известных колониеобразующих единиц.

Иммуноблот.

Приблизительно 1010 фагов наносили на дорожку на 10% полиакриламидном геле. Блокировку проводили 2%-ным сухим обезжиренным молоком в PBS в течение 2 ч при комнатной температуре. Иммуноокрашивание проводили с помощью мышиного mAb против g3p (MoBiTec, Геттинген, Германия), распознающего белок оболочки pIII M13KO7, визуализированного с помощью субстрата 3,3', 5,5'-тетраметилбензидена (TMB) (Promega, Мэдисон, Висконсин).

ИФА с антигенсвязывающим фагом.

Серию разведений антигена BSA-phOx в 100 мМ NaHCO3, pH 8,6, наносили на планшеты MaxiSorb ELISA (Life Technologies) на 16 ч при 4°C. После блокирования неспецифического связывания 2%-ным сухим обезжиренным молоком в PBS в течение 2 ч при комнатной температуре в каждую лунку наносили 2 раза по 109 одноцепочечных фагов, разведенных в 2%-ном сухом обезжиренном молоке в PBS, на 1 ч при комнатной температуре. После шестикратной промывки 400 мкл PBS на лунку связанный фаг выявляли с помощью mAb B62-FE2, как описано выше.

Панорамирование.

Библиотека фрагментов scFv человека в pSEX81 с рассчитанной максимальной сложностью 2×107 была создана из препаратов периферических лимфоцитов, как описано21. Столбнячный токсин, полученный от Virotech (Rüsselsheim, Германия), наносили на шесть лунок ELISA (Life Technologies) в концентрации 0,1 мкг/мл в 100 мМ NaHCO3, pH 8,6, в течение 16 ч при 4°C. Лунки блокировали 2% обезжиренным молоком в PBS на 2 ч при комнатной температуре, после чего в каждую лунку наносили по 1011 фагов библиотеки и инкубировали при 4°С в течение ночи. После пяти промывок PBS/0,1% Tween и пяти промывок PBS связанный фаг элюировали 1 мкг/мл трипсина (Life Technologies) в PBS в течение 15 мин при комнатной температуре. Элюированный фаг использовали для инфицирования 20 мл E. coli XL1blue при OD600 0,4.