Я рецензирую статью «Димеризация гликофорина А обусловлена специфическими взаимодействиями между трансмембранными альфа-спиралями». В аннотации есть утверждение, которое я не понимаю:
«Трансмембранный альфа-спиральный домен, представляющий интерес, слит с С-концом стафилококковой нуклеазы. Полученная химера может экспрессироваться на высоких уровнях в Escherichia coli и легко очищается».
Насколько я понимаю, здесь описывается, что альфа-спираль гликофорина А слита со страфилококковой нуклеазой? Тогда, как же Escherichia coli входит в дискуссию и что означает легкость очистки?
По сути, они разработали вектор, который при трансфекции в E. coli продуцирует транскрипты и, таким образом, белки для слитого гена, который продуцирует эти трансмембранные α-спирали, конъюгированные со стафилококковой нуклеазой. Другими словами, кишечная палочка — это всего лишь фабрики по производству белков:
Экспрессия, экстракция и очистка SN/GpA . Для получения высоких уровней продукции SN/GpA pT7SN/GpA трансформировали в E. coli MGT7 (любезно предоставленную D. LeMaster), содержащую плазмиду pLYS-S.
И аргументация в нем была предложена в дискуссии,
Мы сообщаем здесь об использовании химерного белка, чтобы показать, что присутствия только трансмембранного домена GpA, слитого с обычно мономерным растворимым белком, достаточно для опосредования димеризации этого искусственного мембранного белка - в SDS.
Под легко очищаемым они подразумевают, что белок можно относительно легко извлечь, и в экспериментальном методе они объясняют некоторые общепринятые методы очистки:
Одностадийная очистка миллиграммовых количеств SN/GpA из экстракта может быть достигнута с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой с использованием градиента ацетонитрил/изопропиловый спирт/вода на полупрепаративной колонке Vydac C4. В качестве альтернативы, очистка больших количеств была достигнута с использованием двух циклов катионообменной хроматографии...
... Химера SN / GpA131, но не укороченные формы, может изменять NaCl, 50 мМ Tris-HC1, 5 мМ EDTA, 1 мМ PMSF, 0,025% NaNa, естественно экстрагироваться путем обработки осадка ультразвуком после лизиса клеток при 1 М pH. 7.9, не содержащие моющих средств. Эта экстракция была такой же эффективной, как и с Лубролом, и ее использовали при подготовке материала для получения трансмембранного пептида путем обработки трипсином.