Я пытаюсь экспрессировать GFP в S. cerevisiae, используя промоутер GAL1.
Я всегда выращиваю неиндуцированную (в среде SD на основе декстрозы) культуру рядом с моей индуцированной (в среде SD на основе галактозы) культурой. Я вижу примерно одинаковый очень низкий уровень флуоресценции в обеих культурах, а также полосу при 27 кДа на геле PAGE. Сверхэкспрессии GFP не происходит, флуоресценция на глаз очень слабая, а культуры не зеленеют в видимом свете, как культуры E. coli со сверхэкспрессией GFP.
На геле PAGE количество белка оказалось одинаковым как в неиндуцированных, так и в индуцированных образцах. Мне нужно сверхэкспрессировать белок, такой дырявый уровень экспрессии неприемлем. Как мне это исправить? В настоящее время я выращиваю культуру, чтобы подготовить плазмиду для отправки на секвенирование, чтобы убедиться, что промоторная область плазмиды не повреждена.
Здесь есть пара вещей, которые странны. Во-первых, у вас низкая экспрессия в присутствии галактозы. Промотор GAL1 действительно силен, так что это кажется мне странным. Даже если бы он был негерметичным, индуцированный и неиндуцированный должны быть день и ночь. Тем не менее, вы должны иметь в виду, что вы все равно не сможете увидеть это на глаз. Во-вторых, странно, что в присутствии глюкозы (или декстрозы, в вашем случае) он будет негерметичным. Глюкоза должна не только предотвращать активацию промотора, но и фактически подавлять его.
Несколько возможных исправлений, которые приходят на ум:
1) Проверьте генотип вашего штамма. Некоторые штаммы не имеют gal4, активатора транскрипции промотора GAL1, поэтому, если у вас его нет, система не будет работать в вашем штамме. Точно так же у вас может не быть неповрежденного UAS, что приведет к провалу репрессий. Также могут возникнуть другие проблемы, которые могут сделать штамм непригодным для этой системы.
2) Секвенируйте свой промоутер/ген. Это своего рода боль, но если у вас есть мутация в вашем промоторе Gal1, это может быть причиной всех ваших проблем. Также проверьте БАС, так как это создаст проблемы для репрессий. Наконец, проверьте, вставлен ли сам ген в то место, где, по вашему мнению, он должен быть, если у вас произошел какой-то сбой рекомбинации, это может быть проблемой. Появление дополнительной полосы при низком молекулярном весе заставляет меня подозревать, что это может быть проблемой.
3) В связи с этим попробуйте выбрать другой клон. Возможно, вам не повезло, и у выбранной вами колонии был дефект, и другая колония будет такой, какой вы ее себе представляете.
4) Если вы еще этого не сделали, сделайте свежие запасы среды с галактозой и глюкозой. Может быть, у вас есть примеси или какие-то другие проблемы в ваших средах, и поэтому то, что вы думаете, вы даете клеткам, это не то, что вы даете клеткам.
Во всяком случае, это все, что у меня есть. Удачи!