Как лучше всего экспрессировать два белка в клетке млекопитающего?

У меня есть два белка, и я буду готовить вектор с обоими генами для стабильной трансфекции. У каждого белка будет свой промотор, и я буду использовать вектор piggyBac для вставки в хромосомы одной кассеты с обоими генами. Мои вопросы:

  1. Если я использую один и тот же промотор (CMV, SV40 или индуцируемый) для обоих генов, как это повлияет на уровни экспрессии? Я читал в некоторых статьях, что один из генов может проявляться слабее, чем другой. Если у вас есть личный опыт, буду признателен, если поделитесь им.
  2. Если я использую один и тот же промотор для обоих, но поставлю их далеко (т.е. концы кассеты), повлияет ли снова уровень экспрессии? Это звучит достаточно просто, но я думаю, что люди опубликовали бы что-нибудь, если бы у них был хороший результат.
  3. Если я буду использовать разные промоторы для каждого гена (например, CMV для одного и Tet-индуцируемый для другого), как это будет работать? Я не смог найти документ, в котором использовался бы этот подход, и я хотел бы продолжить этот подход; поэтому, если у вас есть опыт, я буду очень благодарен за любую помощь.

Я не хочу использовать IRES или 2A-пептид. Я хотел бы иметь возможность контролировать этот эксперимент на стадии транскрипции.

Ответы (2)

Вы можете использовать двунаправленный промоутер. Проблема, которую вы упомянули о белках, экспрессируемых не на одном уровне, возникает из-за конкуренции за полимеразу. Но есть хорошо оптимизированные части, а также коммерчески доступные векторы, которые отлично работают.

Вы можете клонировать гены в последовательном порядке. Это не будет проблемой. Просто оставьте линкер длиной 100 п.н. после полиА-сигнала предыдущего гена. Если ваша кассета станет слишком большой, вставить ее будет немного сложнее. Вот почему люди используют IRES или TA-пептиды и т. д.

Вставки на основе ретровирусов работают довольно прилично, но вы не можете контролировать изменение числа копий между разными клетками.

Вы можете использовать два разных промоутера. Динамика будет зависеть от силы промотора и концентрации индуктора.

Спасибо за ваш ответ. Я также изучал двунаправленные промоутеры, но решил попробовать два разных промоутера. Я очень не хотел идти с IRES или 2A, потому что слишком боюсь мешать взаимодействию, лучше не рисковать :). Я скоро начну эксперимент и поделюсь своим опытом здесь, когда получу какие-то результаты.

Я просматривал свои вопросы и понял, что это все еще без ответа. Что ж, теперь у меня есть ответ.

Я разработал конструкцию с двумя отдельными промоторами (CMV для одного и Tet-индуцируемым для другого) и получил действительно хорошие результаты. У меня не было никаких трудностей с экспрессией белков. Я смог очень хорошо контролировать Tet-индуцируемый белок и получил стабильные уровни другого белка с CMV.

Короче говоря, вы можете безопасно поместить два гена под два разных промотора, получить с ними стабильные клеточные линии и получить хорошие уровни экспрессии.

Как лучше всего экспрессировать два белка в клетке млекопитающего?
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v