Как подготовить и клонировать ДНК E. coli?

Я ищу протокол для получения геномной ДНК из образца кишечной палочки , чтобы я мог клонировать небольшую ее часть с помощью ПЦР в плазмиду. (< 500 п.н. в данном случае).

Кажется, OWW (Open Wet Ware) обсуждает только подготовку фрагментированной ДНК. Означает ли это, что мне нужно вырезать его, прежде чем я смогу его клонировать? Любые указатели будут действительно оценены.

Что такое ОВВ? Расширение аббревиатуры или ссылка были бы полезны.
Это вики для описания протоколов консенсуса и организации лабораторных веб-страниц: openwetware.org
@shigeta, не могли бы вы уточнить, что вы подразумеваете под клонированием? Вы хотите включить фрагмент генома кишечной палочки в плазмиду, а затем трансформировать плазмиду для клонирования?
спасибо Mac - редактировать добавил Кевин. @ Mac Правильно - в этом случае я хочу клонировать сегмент < 500 п.н. из генома и вставить его в плазмиду, такую ​​​​как pGLO.
Кто-нибудь все еще ищет ответ на этот вопрос? Экстракция фенолом/хлороформом является золотым стандартом. А вот протокол, специфичный для геномной ДНК E. coli, в котором не используется фенол/хлороформ: bio.classes.ucsc.edu/bio105l/EXERCISES/DNA/genomic.pdf
Ответ, который я получил от коллеги, заключается в том, что для ПЦР из бактериального образца вы можете добавить бактерии прямо в пробирку для ПЦР, даже не лизируя ее. может это настолько очевидно, что никто не подумал об этом сказать....
@shigeta О да, я часто делаю это при скрининге колоний после лигирования/трансформации. Наколите колонию зубочисткой, размешайте в небольшом количестве воды, используйте воду для ПЦР. Я увеличиваю первый шаг 95C протокола ПЦР с 2 минут до 4 минут. Однако эти реакции не самые чистые — если вы амплифицируете ген для последующего клонирования, я бы все же рекомендовал сначала очистить ДНК.

Ответы (2)

Да, вы должны фрагментировать геном, чтобы вставить его в вектор для клонирования; вы не можете «вставить» весь геном E. coli размером 5 Мб в вектор. Трансформировать клетки огромными плазмидами сложно, оптимальным диапазоном является 2-20 т.п.н. В любом случае, если вы хотите получить клон всего генома, подождите 30 минут, и клетка с радостью вас обяжет.

Большинство процедур, которые выделяют геномную ДНК, в первую очередь фрагментируют ее, поскольку она слишком велика и хрупка, чтобы оставаться вместе, и если бы это произошло, большая часть была бы захвачена другими клеточными остатками и выброшена. Перемешивание со стеклянными бусинами является типичным первым шагом к его случайной фрагментации. После этого вы можете переварить ДНК и свой вектор, чтобы поместить на него совпадающие концы, связать их и трансформировать клетки-хозяева.

Если вам нужен целенаправленный подход (извлечение определенного гена, метод, с которым я не знаком), вы можете использовать ПЦР на вашей извлеченной фрагментированной ДНК, так как, надеюсь, будет один неповрежденный сегмент, охватывающий то, что вы хотите.

Чтобы клонировать конкретный ген, вы должны разработать праймеры для ПЦР, которые будут амплифицировать этот ген, а также со специфическими сайтами рестрикции, фланкирующими ваш ген. Сайты рестрикции должны соответствовать сайтам рестрикции, обнаруженным в полилинкере вашей плазмиды. Для лигирования переварите плазмиду, обработайте CIP (чтобы уменьшить векторный фон) и лигируйте ее с очищенным и переваренным продуктом ПЦР. Излишне говорить, что это, вероятно, слишком упрощенное объяснение клонирования; дайте мне знать, если вы хотите получить более подробную информацию.
@JamesPan Я субклонировал гены между векторами, я просто не знал, есть ли какие-либо различия между вектором-> вектором и геномом-> вектором. Это все ДНК, так что в теории нет ничего нового, но я не знаю практических соображений.
я думал, что клонирование означает ПЦР фрагмента генома - я никогда не думал о том, чтобы вставлять фрагменты генома в плазмиду напрямую - для этого вам потребуется много геномной ДНК - звучит сложно.
@NickT Я думаю, что геном-> вектор должен быть тем же общим принципом. Амплификация генов из геномной ДНК должна быть простой (я постоянно амплифицирую гены из ДНК человека). Я обнаружил, что иногда, по крайней мере, в человеческой ДНК, он может раздражать вас, поэтому я пробую различные добавки для ПЦР, такие как ДМСО или бетанин. Используйте ~50 нг геномной ДНК E. coli для своего шаблона, амплифицируйте, получайте продукты и вставляйте их в вектор, как и все остальное.
@JamesPan не стесняйтесь публиковать еще один ответ; ваш опыт и глубина знаний кажутся лучше моих. Чем больше ответов, тем лучше.
такое ощущение, что вы рассказываете мне, как провести ПЦР что-то из геномной ДНК, в то время как я надеюсь на протокол очистки хромосомной ДНК, чтобы скопировать ее с помощью ПЦР ...

Привет всем, я думаю, что не знал, как правильно сформулировать этот вопрос. После того, как я спросил коллегу, мне сказали, что мне вообще не нужно готовить ДНК для этого крошечного небиблиотечного сценария.

Она сказала мне просто взять небольшой мазок бактерий на зубочистку и поместить его в реакцию ПЦР с мастер-миксом, а фермент и циклы нагревания сделают все остальное.

Может быть, этот вопрос был слишком простым - извините, если это было так.

(Конечно, он работал нормально.)

Как подготовить и клонировать ДНК E. coli?
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v