Проточный цитометрический подсчет апоптотических адгезивных клеток

Я пытался измерить скорость апоптоза в эпителиальных клетках, маркируя апоптотические клетки аннексином V, конъюгированным с фикоэритрином (PE), и сортируя их с помощью проточной цитометрии. К сожалению, клетки являются адгезивными, и их культивировали в чашках, покрытых коллагеном. Таким образом, чтобы приостановить их для проточной цитометрии, я использовал обработку трипсином. К сожалению, мои результаты были довольно плохими. Я считаю, что есть несколько проблем. Во-первых, обработка трипсином, вероятно, вызывает разрушение интегральных мембранных белков, потенциально вызывая экстернализацию фосфатидилсерина (PS) (с которым связывается аннексин) на внешней плазматической мембране клеток. Поскольку клетки инкубировали с аннексином V после суспензии с трипсином, это могло привести к существенному увеличению кажущейся скорости апоптоза. и маскировали реальные различия между скоростью апоптоза в клетках WT и KO. Кроме того, мне сообщили, что эпителиальные клетки, чтобы сохранить свою структурную целостность, имеют относительно большое соотношение цитоплазмы к ядру и заметный цитоскелет, что приводит к усилению фонового шума (зеленоватого цвета). Чтобы решить эти проблемы, я рассматривал несколько альтернатив, таких как изменение флуоресцентного маркера, с которым конъюгирован аннексин V, для уменьшения интерференции аутофлуоресценции, использование другого маркера апоптоза (вместо аннексина V) или, если бы я продолжая использовать аннексин V, я думаю, что инкубация с аннексином V с последующим отмыванием избытка аннексина и только после этого обработка трипсином потенциально может решить одну из моих различных проблем (или, опять же, может и не решить). Пожалуйста, помогите мне найти подходящий протокол для проточного цитометрического анализа маркеров апоптоза в прикрепленных эпителиальных клетках. Кроме того, если вам известны какие-либо исследования, в которых используются такие методы, пожалуйста, направьте меня к ним. Заранее спасибо.