Забыли вортексировать антитела перед окрашиванием

Фу. Провел эксперимент по иммунофлуоресценции в прошлые выходные, забыл вортексировать растворы первичных и вторичных антител.

И мой окончательный результат выглядит тусклее, чем должен быть. Возможно ли, что этому способствовало не вортексирование?

Я думаю, вопрос в том, действительно ли вортексирование необходимо? Это сводилось к динамике жидкости. Сколько времени требуется, чтобы капля антитела достигла равновесия в пробирке Эппендорфа объемом 1000 мкл? Действительно ли это больше, чем несколько секунд? Действительно ли вортекс необходим?

Ответы (1)

Это зависит от того, сколько времени прошло между добавлением концентрированных антител в раствор для разведения и добавлением разведенных антител на предметное стекло. Если бы это было всего пару секунд, то я бы точно увидел разницу. Даже если бы это было дольше, скажем, даже 30-90 секунд, потенциально в растворе могли бы быть градиенты антител без вортексирования. Есть несколько причин, почему. Во-первых, многие неконъюгированные первичные антитела, которые не предназначены только длядля иммуноокрашивания поставляются в растворе глицерина с концентрацией от 10 % или около того до 50 % или более, иногда в дополнение к белку-носителю, такому как BSA (я работал в известной компании по производству антител, и их 50% глицерин с 10 мкг - 2 мг БСА на мл, в зависимости от типа антител). Глицерин предотвращает замерзание раствора при температуре -20°C, устраняя образование кристаллов льда, защищая белок антитела от деградации и обеспечивая более длительное время хранения без потери активности. В результате, однако, требуется больше времени для растворения раствора в PBS или любом другом разбавителе, который вы используете сам по себе, без дополнительной механической активности.

С другой стороны, даже если первичное (или вторичное) антитело просто приготовлено в PBS, равномерная диффузия белков во все части пробирки может занять некоторое время. В качестве эксперимента поместите 1 мл PBS в пробирку Эппендорфа, затем добавьте, возможно, 10–50 мкл темного красителя, такого как метиленовый синий, бромфеноловый синий или трипановый синий. Наблюдайте, как он со временем растворяется в растворе на сплошном белом фоне, подобно листу бумаги. Хотя ни один из них не имеет такого же профиля растворимости, как антитела, этого достаточно, чтобы показать вам, что происходит в течение первых 30 секунд или около того, пока вы больше не сможете различать краситель.

Так что всегда делайте вортекс, даже если он на относительно медленной скорости, в течение пары секунд, чтобы убедиться, что все равномерно распределено.

Я предполагаю, что небольшая молекула красителя, вероятно, будет диффундировать быстрее, чем большое антитело. Таким образом, если красителю требуется время, чтобы заполнить весь объем, то антителу, вероятно, потребуется больше времени.
@ user137 это именно моя точка зрения.
Меня учили никогда не встряхивать белки, если я хотел сделать что-то полезное, но равномерное смешивание (пипетированием, инверсией, расширенной нутацией или чем-то еще) раствора в значительной степени требуется для того, чтобы мы могли сказать что-то осмысленное о любой биохимической реакции. В заключение, ответ @MattDMO правильный, учитывая местные различия в методологических обычаях.
@MaximilianPress тебя неправильно учили. Единственный белок, который я не встряхиваю, это ДНКаза I, используемая для расщепления ДНК на спин-колонке для подготовки РНК — и только потому, что в инструкции сказано не встряхивать ее. Белки, как правило, очень структурно стабильны, и слабая сила, такая как встряхивание, ничуть не повредит их, я обещаю. Я работаю с белками почти 20 лет, и я никогда не встречал биохимика, который сказал бы, что белки вообще или антитела в частности не должны перемешиваться. Теперь, если вы делаете, например, совместные IP с нативной конформацией, вы, конечно, можете быть немного больше (...)
(...) деликатнее, чем при работе с антителом для вестерн-блоттинга или иммунофлуоресценции, но и там опасность больше тепла, чем физической силы. Антитела невероятно прочные и устойчивые, часто могут работать в широком диапазоне химических сред, и, как правило, требуют специальной обработки только тогда, когда они конъюгированы со светочувствительными флуорохромами. Да, вы не хотите, чтобы в вашем растворе обязательно образовывались пузырьки, но опять же, это только тогда, когда вы работаете в конформационно-чувствительном анализе.
Спасибо за Ваш ответ. Я предполагаю, что они не содержат глицерина, так как хранятся при -4 градусах. Тем не менее, хорошая вещь, чтобы рассмотреть. Обязательно попробую эксперимент с краской. Кстати, сколько времени нужно, чтобы антитела «испортились» при -4 градусах? Могло ли это способствовать?
@amd1972 @ amd1972 просто дружеское напоминание - если этот ответ касается вашей проблемы , рассмотрите возможность его принятия , нажав на галочку / галочку слева от ответа, сделав его зеленым. Это помечает вопрос как решенный к вашему удовлетворению и присуждает репутацию как вам, так и человеку, который ответил. Если у вас >= 15 очков репутации, вы также можете проголосовать за ответ, если хотите. Обязанности делать тоже нет.
@ amd1972 в ответ на ваш вопрос - это зависит. Если в антителе есть азид натрия, оно не должно загрязняться, особенно если вы используете наконечники пипеток с фильтром (я больше никогда не использую обычные наконечники). Вы можете уточнить у поставщика, проводили ли они какие-либо исследования стабильности, или есть ли у вашей партии срок годности. Пока вы с ним осторожны, он должен прослужить как минимум пару лет - некоторые могут прослужить намного дольше, другие - не так много. Если вы хотите, вы можете добавить к нему 50% глицерин и хранить его при -20, не забывая маркировать его и изменять коэффициент разбавления.
Потрясающе, спасибо. Последний вопрос. Я создал еще одну тему по этому поводу: как насчет этапа охлаждения льдом после извлечения антигена, который используется в большинстве протоколов иммунофлуоресценции? Я тоже забыл этот шаг. Я учился в школе и давно не проводил этих экспериментов, так что, как вы понимаете, я заржавел.
@ amd1972 amd1972 не уверен в этом - я обычно окрашиваю клетки, а не ткани, и я немного заржавел на своем IHC.
Забыли вортексировать антитела перед окрашиванием
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v