Я измерял концентрации белковых растворов, разбавляя их водой в 20 раз с конечным объемом 100 мкл, а затем измеряя оптическую плотность этих растворов в 96-луночных планшетах с помощью планшет-ридера. Я не помню, чтобы у меня были проблемы до сегодняшнего дня.
Я использовал 20 мМ фосфатный буфер вместо воды, чтобы развести их сегодня, и трижды измерял оптическую плотность при 280 нм, и абсорбция для одного из растворов увеличилась с 0,043 до 0,068 (абсорбция 20 мМ фосфатного буфера составляет 0,030 при 280 нМ с одинаковый объем); Я перестал измерять после третьего, но он, вероятно, будет расти, пока я не достигну плато.
Я измерил поглощение двух белков, и только один из них увеличился так сильно, другой увеличился с 0,071 до 0,088; если бы это зависело от концентрации, я бы ожидал, что второе решение пойдет еще выше, но этого не произошло.
Я знаю, что могут быть различия в поглощении УФ-излучения, если белок свернут или развернут; будет ли это так драматично? В чем причина такого увеличения? Буду признателен за объяснение и практическое решение проблемы.
ПРИМЕЧАНИЕ. Я увеличил общий объем до 200 мкл, просто добавив 100 мкл 20 мМ фосфатного буфера во все лунки, и увеличение сигнала значительно замедлилось; все еще есть некоторое увеличение, хотя с шагом 0,001-0,003 в каждом измерении.
Похоже, ваши концентрации белков находятся на пределе обнаружения спектрофотометра, а изменение буфера-разбавителя изменило их концентрации. Образцы, возможно, не были тщательно перемешаны после разбавления и перед измерением, поэтому различные измерения могут быть просто раствором, приходящим к равновесию. Температура также может влиять на абсорбцию, поэтому прежде чем делать какие-либо выводы, убедитесь, что ваши образцы уравновешены. Если абсорбция вашего фосфатного буфера составляет 0,03, я бы попытался сохранить абсорбцию образца выше 0,075 или выше, чтобы не слишком приблизиться к пределу обнаружения. Кроме того, убедитесь, что ваш буфер не слишком старый и не загрязнен чем-то, что может повлиять на его характеристики поглощения.
Я бы посоветовал взять один или два образца белка и провести серию разведений (1:1, 1:5, 1:10, 1:20) в большом объеме (скажем, по 400 мкл каждый, если вы можете сэкономить). Встряхивайте в течение короткого времени, чтобы хорошо перемешать, затем измеряйте трижды каждого разведения на вашем ридере вместе с соответствующими бланками (только буфер). Вы увидите различия между каждым измерением, но они должны быть довольно небольшими, в зависимости от точности и прецизионности вашего прибора.
Измеренные значения не будут точно такими же от измерения к измерению, и потребуется намного больше трех повторений, чтобы определить, имеет ли место фактическая тенденция дрейфа. Измеряйте свою пластину для образцов каждые 5 минут в течение часа и наносите значения на график (не просто смотрите на них), чтобы увидеть, не нуждается ли машина в обслуживании.
Это может быть разворачивание белка или изменение конформации. Поглощение при 280 нм в основном связано с остатками триптофана и может существенно меняться по мере того, как эти остатки перемещаются из более гидрофобной (похороненной внутри белка) в более гидрофильную (подверженную воздействию растворителя) среды. Ваш белок может реагировать на новый буфер.
Алан Бойд
Энгин Япичи
МэттДмо
Энгин Япичи