Связывание двухвалентного катиона с кальмодулином

Я провел собственный PAGE с 4 реакционными смесями. К каждому я добавил равный объем ЭДТА (1 мкл/1 мМ) для секвестрации любых двухвалентных ионов и равный объем кальмодулина (5 мкл/0,5 мг/мл). Я добавил 2 мкл ионов кальция (2 мМ), магния (2 мМ) и марганца (2 мМ) соответственно к трем реакционным смесям и имел контроль, который был доведен до равного объема Трис-HCl. Все реакционные смеси доводили до 10 мкл Трис-HCl. Здесь я столкнулся с проблемой водяных бань, и реакции нельзя было инкубировать при 37 градусах Цельсия.

После того, как я добавил загрузочный буфер к каждому, я добавил 4 реакционные смеси в полиакриламидный гель и провел электрофорез в течение 45 минут при 150 В. После этого я поместил гель в краситель Кумасси синий на 20 минут.

После процесса обесцвечивания я просмотрел гель и обнаружил, что кальмодулин на 4 дорожках мигрировал на одинаковое расстояние. Я ожидал, что ЭДТА-контроль мигрирует на геле дальше всего, при этом Ca2+ и Mn2+ мигрируют на аналогичные расстояния из-за их одинаковых ионных радиусов; что делает его хорошей заменой для связывания с кальмодулином. Я не был уверен в том, как далеко может пройти Mg2+, так как я думал, что он будет иметь более низкое сродство к кальмодулину из-за его связывания с N-концом, а не с C-концом. Однако мне было интересно, было ли это незначительным в отсутствие Ca2+, хотя теперь я не могу быть уверен из-за результатов геля.

Мне было интересно, какие ошибки в экспериментальном дизайне или процессе могли привести к этому? И если бы эксперимент был проведен правильно, каких результатов можно было бы ожидать?

Первое изображение - результат, которого я ожидал. Во-вторых, это результаты моего гель-электрофореза.

Это был результат, которого я ожидал

Вот результат, который я получил

Зачем добавлять ЭДТА, если вы хотите, чтобы кальмодулин связывал ионы? Вы ожидаете, что только связывание ионов повлияет на скорость миграции?
Связывание катиона не сильно изменит подвижность, чтобы ее можно было обнаружить с помощью электрофореза.
Если вы хотите изолировать двухвалентные ионы, вам нужно больше ЭДТА. Он образует комплексы с эквивалентным количеством ионов, поэтому 1 мМ ЭДТА образует комплексы с 1 мМ кальция (например). Если ваш раствор ЭДТА 1 мМ, а ионный раствор 2 мМ, это никогда не сработает.
Извинения, были внесены изменения, чтобы включить концентрации. ЭДТА была добавлена ​​по указанию моего руководителя, что я в то время сомневался. У меня сложилось впечатление, что миграция будет обнаружена в существующей литературе.
А при добавлении ЭДТА в каждую реакционную смесь необходимо было изолировать любые двухвалентные ионы от белка до того, как были добавлены целевые ионы (Ca2+, Mg2+ и Mn2+) соответственно. Я думал, что связывание ионов на этом этапе не будет прервано, так как ионы находятся в двукратном молярном избытке ЭДТА и, следовательно, могут связывать кальмодулин и вызывать его замедление? Что будет подобрано на гелях?
Из какой статьи эта цифра? Кроме того, вы должны очистить свой гель.
Вы не можете увидеть изменение мобильности в SDS-PAGE (даже на этом изображении, которое утверждает это). Сдвиг в нативном PAGE происходит из-за конформационных изменений при связывании ионов. Более того, маловероятно, что ион остается связанным с белком в денатурирующих условиях SDS-PAGE.

Ответы (1)

Изменение расстояния миграции геля связано с конформационными изменениями из-за связывания иона и не имеет ничего общего (поддающегося обнаружению) с ионным радиусом иона.

Левое изображение показывает кальмодулин без связанного лиганда, а правое изображение показывает его со связанными с ним кальцием и пептидом.

введите описание изображения здесь введите описание изображения здесь

Как вы можете ясно видеть, несвязанный кальмодулин значительно тоньше и, следовательно, может быстрее мигрировать через гель. Изменение заряда белка из-за связывания катионов в нативном ПААГ также может повлиять на результат.

Поскольку конформационное изменение кальмодулина усиливается как пептидом, так и катионами кальция , а также состоянием его фосфорилирования, было бы разумно исследовать вклад этих факторов в ваш результат. Также может быть полезно перечитать исходную статью еще раз, чтобы увидеть, что вы пропустили в первый раз.

Да, левая панель представляет собой апо-кальмодулин, но Ca(II)-кальмодулин также напоминает структуру на левой панели (с незначительной структурной корректировкой). Основное конформационное изменение на правой панели является результатом связывания пептида, которое не является частью рассматриваемого эксперимента.
@SYK Я почти уверен, что пептид не может связываться без связывания кальция.
Связывание двухвалентного катиона с кальмодулином
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 1v