Как охарактеризовать стабильность белка по кривым флуоресценции Trp и [денатуранта]?

Документы, которые я видел с использованием этого метода, показывают, что можно рассчитать долю денатурированного белка путем анализа смещения длины волны пикового излучения.

Вы пытались сделать это с вашими данными? Что получится, если построить график зависимости длины волны пикового излучения от концентрации денатурирующего агента? Если они выглядят как сигмоидальные кривые (вам может понадобиться логарифмическая шкала по оси X) с четким верхним плато, то вы можете применить метод, упомянутый в этих статьях, потому что наблюдаемый сигнал коррелирует с долей денатурированного белка и насыщенных веществ ( эта часть важна: сигнал должен насыщаться после определенной концентрации денатурирующего агента, потому что все молекулы белка полностью денатурированы, и поэтому добавление большего количества денатурирующего агента не приведет к дальнейшему изменению сигнала; если ваш сигнал не насыщается, что-то не так) .

Однако они используют мономерные белки с небольшим количеством Trp, тогда как у меня есть димер с несколькими Trp.

Олигомерное состояние и количество остатков Trp не должны иметь значения, поскольку длина волны пиковой эмиссии коррелирует только с долей денатурированного белка. Общая интенсивность будет увеличиваться с увеличением количества остатков Trp, но вы не используете интенсивность в качестве меры доли денатурированного белка (и, во всяком случае, хорошо иметь большую интенсивность для начала, учитывая эффект тушения, который вы наблюдаете при увеличении концентрации денатурирующего агента). ).

плюс некоторая дополнительная изменчивость, вносимая различными лигандами.

Чтобы решить эту проблему, вам нужны два элемента управления, которые:

1. доказать, что ни один из лигандов не изменяет флуоресценцию вашего белка,
2. доказать, что ни один из лигандов не излучает флуоресценцию в диапазоне от 300 до 450 нм, а если да, то вам необходимо измерить его, чтобы иметь возможность вычесть его из ваших общих спектров, чтобы восстановить вклад белка в общую флуоресценцию.

Для 1 запишите спектры испускания флуоресценции белка без денатурирующего агента, но в зависимости от концентрации лиганда (диапазон в несколько порядков) и посмотрите, изменяется ли длина волны пикового испускания при связывании лиганда (она может измениться, что означает, что один и тот же анализ может кривые связывания и значения Kd для ваших лигандов, которые также могут быть полезны!). Полные кривые титрования лиганда были бы наиболее надежным контролем, но вы можете просто использовать те же концентрации лиганда, что и в экспериментах по денатурации.

Для 2 самым простым случаем будет то, что ваши лиганды не флуоресцируют, но вы не можете просто предположить это. Следовательно, важным контролем, который вам также необходим, является запись спектров излучения для каждого из ваших лигандов при концентрациях, используемых в экспериментах по денатурации, и это при каждой концентрации денатурирующего агента (или просто при 0 и максимальной концентрации: если нет никакой разницы между этими два спектра, вам не нужно записывать по одному для каждой промежуточной концентрации). Если лиганды излучают флуоресценцию в диапазоне от 300 до 450 нм, вам необходимо вычесть это из общего спектра, чтобы восстановить флуоресценцию, возникающую только от белка.