Оптимальный рН белкового буфера? Основные принципы настройки буферов в соответствии с методом и анализом

Белковые буферы, такие как PBST, который используется в вестерн-блоттинге, обычно доводят до pH 7,4. Когда я пытаюсь понять почему, я нахожу некоторую информацию об оптимальной pKa для стабильности белка. Я не уверен, что действительно понимаю это, потому что кажется, что независимо от белка - большинство лабораторий просто используют PBST с pH 7,4.

Мне немного любопытно, и у меня есть несколько вопросов

  • Почему pH 7,4 установлен в качестве стандарта для вестерн-блоттинга?
  • Для оптимального вестерн-блоттинга pH всегда должен быть выше pI белка? (поскольку 7,4 кажется немного высоким)
  • Должен ли pH буфера быть равным pI белка для экстракции перед SDS-pAGE и при промывке NC-мембран после блоттинга?
  • Как рассчитать оптимальный рН или оценить/думать об этом при работе с белком?
Это средний рН внеклеточной жидкости и цитоплазмы, но он может варьироваться. Компартменты, такие как лизосомы и митохондриальный матрикс, будут иметь различный рН. В функциональных исследованиях с нативными белками следует использовать буферы pH с правильным значением pH. Во время вестерн-блоттинга белки денатурируются, поэтому их изоэлектрические точки/функциональный рН не имеют значения. pH в SDS-PAGE регулируется в соответствии с изоэлектрической точкой глицина, что помогает в укладке белков.
Спасибо! Таким образом, в основном все, что вам нужно, это pI глицина, поэтому pH 7,4 является оптимальным pH для вестерн-блоттинга.
Ну... это важно для SDS-PAGE... Не для этапа блоттинга. Конкретный рН может иметь дифференциальный эффект. Я действительно не думал об этом. Хороший вопрос. Я посмотрю.
Еще раз спасибо, это интересно, и я думаю, что важно получить общее представление о том, как все работает. Я добавлю это отражение как точку в моем вопросе выше!

Ответы (1)

Правильный рН зависит от свойств белков, которые вы пытаетесь использовать. Они сильно различаются между извлечением белков из ткани и проведением вестерн-блоттинга.

Экстрагирование белков означает поддержание их растворимости в водном растворе. Работа с pI белка может быть наихудшим выбором, поскольку в этом случае белок не имеет чистого заряда, что обычно снижает его растворимость в воде. Крайним случаем могут быть высокоосновные гистоновые белки с очень высокими значениями pI, которые лучше всего экстрагируются при низком pH.

После обработки белков на денатурирующем геле и переноса их на мембрану для Вестерн-блоттинга они уже денатурированы и прочно связаны с мембраной за счет гидрофобных взаимодействий, на которые pH мало влияет, за исключением, возможно, экстремальных значений. Для блоттинга вы хотите использовать взаимодействие эпитопов на белке с антителами против них. Во время продукции антител взаимодействия между эпитопами и антитело-специфическими рецепторами на клетках, продуцирующих антитела, происходят при нормальном рН внеклеточного тела, равном 7,4. Использование этого pH для блоттинга лучше всего воспроизводит состояние заряда как эпитопов, так и антител, которое существовало, когда были отобраны клетки, продуцирующие наилучшие антитела.

Оптимальный рН белкового буфера? Основные принципы настройки буферов в соответствии с методом и анализом
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v