Почему вы должны использовать температуру отжига примерно на 5°C ниже Tm ваших грунтовок?
Согласно моему текущему исследованию, я думаю, что это как-то связано с другими реагентами в ПЦР, но я не уверен.
Вы хотите иметь праймеры, которые связываются в условиях реакции только с интересующей вас последовательностью. Если вы зайдете слишком далеко от оптимальной температуры отжига (на 5°C ниже Tm, по моему опыту, это действительно относительно хороший выбор), это повлияет на эффективность ПЦР и, следовательно, на выход вашей реакции.
Температура отжига, которая слишком низкая, позволяет отжиг ваших праймеров на других сайтах, чем ваша предполагаемая цель, с частичным отжигом или внутренними несоответствиями оснований. Это приводит к неспецифической амплификации и снижению выхода.
Если температура отжига слишком высока, праймер не связывается, и вы не получите продукт ПЦР. В качестве альтернативы, частичное связывание также может привести к неправильному запуску продуктов, хотя это гораздо менее вероятно, чем отсутствие продукта вообще.
Температура отжига праймера определяется как температура, при которой 50% нуклеотидов праймера связаны с ДНК. Пропорция отжига 50% не даст оптимального продукта РСТ. Таким образом, при понижении температуры примерно на 5°С доля связанного праймера изменяется до более чем 50% (возможно, около 70-80%), что позволяет получить более точный выход.
Вот почему мы вычитаем 5oC из теоретической температуры отжига.
Крис
А. Радек Мартинес
Крис