Проблемы Laemmli-SDS-PAGE [закрыто]

Ваш гель выглядит просто отлично для меня. Это просто указывает на то, что ваш осадок сульфата аммония содержит огромное количество этого маленького белка на дне (что бы это ни было). Верхние полосы выглядят нормально, загруженность соответствующая: они не перегружены, как нижние, но и не слишком бледны. Тот факт, что ваши первая и последняя дорожки выглядят немного размытыми, объясняется огромным количеством мелкого белка (дорожки действительно выглядят грязными, когда они настолько перегружены). Нижняя полоса определенно представляет собой некоторое количество белка, а не артефакт окрашивания; Я видел эту форму раньше с очищенными белками, перегруженными в SDS-PAGE.

Одна вещь, которую вы могли бы сделать, предполагая, что у вас все еще достаточно этих образцов, — запустить дополнительный гель со в 100 раз меньшим количеством материала. Разбавьте в 1/100 раз в денатурационном буфере Лэммли 1X и загрузите новый гель того же объема, что и этот. Вы больше не увидите верхних полос, но у вас будет гораздо более чистая нижняя полоса, которой вы, надеюсь, сможете присвоить кажущуюся молекулярную массу (или даже вырезать ее для идентификации в масс-спектре; надевайте перчатки и используйте чистые инструменты, если вы сделайте это, иначе они в основном обнаружат кератин на вашей коже).

Предполагая, что целью этого геля было проверить результат осаждения сульфата аммония, используемого в качестве этапа очистки, очевидно, что разделение всех этих полос не сработало, и вам, возможно, придется повторить и попробовать разные концентрации. Но если вы пытаетесь очистить нижнюю полосу, то вы добились успеха (верхние полосы представляют менее 10% загрязнения, я бы сказал, по оценке на глаз). Если вас интересует одна из топовых полос, то это явно не сработало.

Является ли одна из этих дорожек супернатантом? Если это так, у вас также есть огромное количество мелкого белка (он есть на каждой дорожке). Такое высокое обогащение выглядит подозрительно: может быть, это очищенный лизоцим, который вы добавили во время процедуры очистки, чтобы помочь разрушить клеточную стенку бактерий? (при условии, что вы пытаетесь очистить белок, сверхэкспрессированный в E. coli ).