Вопрос, связанный с иммунопреципитацией для идентификации взаимодействующих белков?

Используя рекомбинантный Flag-меченый Dcr-2 и His-меченый белок X, были проведены анализы pull-down, чтобы определить, взаимодействуют ли белок X и Dcr-2 напрямую. Рекомбинантные белки (по отдельности или в комбинации) в буфере для связывания (150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 50 мМ Трис, рН 7,5, 1% Тритон Х-100) поглощали антителами Flag, связанными с гранулами сефарозы. После тщательной промывки белки элюировали с шариков SDS-буфером, а повторяющиеся наборы образцов анализировали с помощью SDS-PAGE. Образцы белков также были взяты до того, как они были использованы в анализе вытягивания, и они были запущены на том же геле (входные дорожки на рисунке 2B). Один гель окрашивали кумасси синим красителем (рис. 2А), а другой переносили на нитроцеллюлозу для вестерн-блоттинга. Мембрану исследовали с помощью His-антитела (рис. 2В).

введите описание изображения здесь

Возникает вопрос: взаимодействуют ли Dcr-2 и белок X напрямую?

Я полагаю, что они ДЕЙСТВИТЕЛЬНО взаимодействуют напрямую. На рис. 2B: интенсивные полосы на LHS показывают, что Dcr-2 взаимодействует с белком X-, который связан с анти-His. На рис. 2А: белок X взаимодействует с Dcr-2, связанным с антителом FLAG. Я чувствую, что не очень это объясняю... Может кто-нибудь объяснить свои рассуждения? Спасибо

Если ответ вас не удовлетворил, было бы здорово рассказать мне о проблеме в комментарии, чтобы я мог ее исправить. Спасибо.

Ответы (1)

Во-первых: вы правы в своих рассуждениях о том, что белок X (X) и Dcr-2 взаимодействуют напрямую. Давайте пройдемся по пятнам: на входе вы проверяете белки, загруженные в оправу, и неспецифически окрашиваете Кумасси. Эта часть блота не показывает неспецифического входа, и присутствуют оба представляющих интерес белка. Это также показывает, что Dcr-2 намного больше, чем X, что позволяет легко идентифицировать образцы полос.

В элюате вы увидите только те белки, которые связаны непосредственно в реакции или взаимодействуют со связанными белками. Dcr-2 помечен флагом, поэтому он напрямую связывается с гранулами и может быть элюирован с них. Это показано в части пятна кумасси. Только Dcr-2 связывается и может быть элюирован, в то время как один X не связывается и, следовательно, не дает сигнала. Dcr-2 и X вместе дают две полосы, поскольку Dcr-2 связывается с гранулами, а X взаимодействует с Dcr-2.

Это связывание также показано с антителом против His, которое распознает только белок X. Белок появляется во входных данных, где добавлен X. Он также появляется на дорожке элюции (где также присутствует Dcr-2), показывая, что X является партнером по взаимодействию с Dcr-2.

Вопрос, связанный с иммунопреципитацией для идентификации взаимодействующих белков?
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v