Оказывает ли мочевина в различных концентрациях (5 или 0,5 М) различное влияние на белки?

Что вам нужно сделать, так это сравнить относительное количество белка в нерастворимой фракции (гранулы) с растворимой (супернатант). Таким образом, вы можете определить, насколько растворимым стал RMAS под действием указанного соединения.

ДТТ разрывает дисульфидные связи, но не делает ничего другого для растворения белка, поэтому он весь находится в осадке, и ничего не обнаруживается в супе. NaCl — это соль, которая увеличивает ионную «силу» буфера для лизиса, но на самом деле ничего не делает для растворения белка, поэтому снова вся мишень остается в осадке. С другой стороны, детергенты , такие как Triton и SDS, освобождают белок от нерастворимой фракции и перемещают большую его часть в супернатант, что приводит к тому, что вы видите для них. В зависимости от точной субклеточной локализации интересующего белка, а также от количества и комбинации используемых детергентов, вы можете вообще не увидеть белка в осадке, так как он полностью солюбилизирован.

Мочевина и гидрохлорид гуанидиния являются хаотропными агентами , разрушающими водородные связи, силы Ван-дер-Ваальса и ослабляющими гидрофобные ассоциации, вызывая денатурацию белка и его отделение от других белков в осадке, тем самым помещая его в супе. Этот эффект обычно наблюдается при относительно высокой молярности (например, GuHCl часто используется в диапазоне концентраций 6-8 М), что объясняет разницу в эффекте, наблюдаемую при 0,5 и 5 М мочевине. При низких концентрациях мочевины недостаточно для эффективной денатурации белка. Я немного удивлен, что на полосе 0,5 М ничего не появилось, однако это всего лишь смоделированный вестерн, показывающий идеальные результаты - в реальной жизни все почти никогда не бывает таким шаблонным.