Активность глюкокиназы

Прежде всего, давайте посмотрим, чего хотят добиться эти ребята: они хотят использовать бактерии для производства определенных продуктов. Для этого они хотят использовать бактериальный метаболизм на этапах, где нет альтернативных путей. Одним из таких этапов является первый этап гликолиза, когда глюкоза фосфорилируется до глюкозо-6-фосфата (G6P). У бактерий фосфорилирование осуществляется во время импорта глюкозы в клетку с помощью «системы фосфоенолпируват (ФЕП): углеводная фосфотрансфераза», которая использует фосфоренолпируват в качестве источника фосфата. Недостатком этого является то, что внутри клетки почти нет свободной глюкозы, а в основном G6P.

Чтобы преодолеть эту проблему, группа выделила альтернативные транспортеры (которые транспортируют глюкозу в клетку) и глюкокиназу (Glk), чтобы позволить клеткам выжить. Эти шаги отделили импорт и фосфорилирование глюкозы и привели к образованию свободной глюкозы внутри клетки. Эта свободная глюкоза теперь может использоваться в различных процессах. Это также делает возможным гликолиз, поскольку Glk фосфорилирует глюкозу, которая затем вступает в путь гликолиза. Glk помещали под разные промоторы, чтобы получить разные мутанты, чтобы проверить, как различная экспрессия Glk влияет на жизнеспособность клеток.

Чтобы ввести другой фермент, который также метаболизирует глюкозу, они использовали глюкозодегидрогеназу (Gdh), которая экспрессировалась из плазмиды с сильным промотором, индуцируемым IPTG. Затем они использовали различные концентрации IPTG, чтобы проверить влияние на выработку глюконата и жизнеспособность клеток (я не буду вдаваться в подробности).

Рисунок выше представляет собой рисунок 5 из статьи и показывает эффект трех различных концентраций IPTG, используемых для индукции экспрессии Gdh. Для 10 и 25 микромоль IPTG выход глюконата становится тем меньше, чем выше становится активность Glk. Только малая активность показывает более низкий выход. Это совершенно другое для самой высокой концентрации, но здесь клетки, вероятно, запутались из-за высокой экспрессии Gdh (который также потребляет много энергии).

В статье не дается пояснений или, по крайней мере, обсуждается поведение выхода глюконата при наименьшей активности Glk (хотелось бы прочитать комментарии рецензентов по этому поводу). Судя по данным, я бы ожидал более высокой производительности. Возможно, что более низкое производство энергии (низкое количество G6P означает слабый гликолиз) имеет негативные побочные эффекты на клетки. Также возможно, что Gdh ингибируется при более низкой активности Glk некоторыми другими веществами в клетке. Активность Gdh, например, ингибируется более высокими концентрациями нуклеотидтрифосфатов (АТФ и т. д.), см. здесь . Поскольку Glk нуждается в АТФ в качестве кофактора, вполне возможно, что концентрация АТФ при более низкой активности Glk оказывает негативное влияние на активность Gdh (мое собственное предположение).

Или это просто какой-то артефакт из эксперимента. В нем есть некоторые моменты, которые можно подвергнуть критике (я также хотел бы увидеть здесь комментарии рецензентов). Во-первых, планки погрешностей довольно большие, так что это тоже может несколько отличаться. В тексте они упоминают, что данные были получены

не менее 2 параллельных культур в репрезентативном эксперименте

Я бы ожидал еще несколько повторений (по крайней мере, три независимых эксперимента), что сделало бы данные более надежными. Тогда (и этот момент гораздо важнее) они не могут измерить активность Glk и Gdh в одной и той же культуре из-за ограничений в системе детекции. Для измерения активности Glk используется связанная система, которая в конечном итоге измеряет изменение концентрации NADH, в то время как Gdh использует NADPH в качестве кофактора. Обе версии нельзя отличить путем измерения спектра, поэтому измерения активности Glk можно проводить только в нетрансфицированных клетках. Так как выражение изменяет условия в ячейке (а мы не знаем как), я ожидал бы хоть какого-то обсуждения по этому поводу, но оно отсутствует.