Интересующий кластер генов не амплифицируется в ПЦР

В лаборатории у меня сейчас есть образец Rhizobium sp. НТ-26. Эта бактерия является хемолитоавтотрофным окислителем арсенита, и я хочу клонировать гены арсенитоксидазы в другой штамм бактерий в надежде на экспрессию этих генов и узнать больше об окислении арсенита и устойчивости к нему. Моим первым шагом в этом эксперименте была очистка плазмидной ДНК колонии NT-26, которую я вырастил на чашке с TSA. Для этого я использовал плазмидный мини-набор Omega Bio-teK EZNA I. После использования набора у меня осталось 40 мкл раствора плазмидной ДНК. После этого я хотел амплифицировать интересующие гены с помощью ПЦР. Последовательность этого кластера генов указана в списке нуклеотидов NCBI прямо здесь: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AY345225.. Мои основные проблемы в этом проекте заключаются в разработке правильных праймеров для правильной амплификации, а также в том, что эта последовательность состоит из 9 килобаз, поэтому мне потребуется высококачественная смесь taq-полимеразы. Основная проблема, на которой я остановлюсь, это дизайн праймеров. Во-первых, я знал, что буду клонировать этот кластер генов в плазмидный вектор экспрессии для электропорации в штамм E. coli. Из-за этого я решил, что хочу разработать свои праймеры с уже прикрепленными сайтами рестрикции. Короче говоря, я пробовал ПЦР в общей сложности 17 раз, и я не нашел правильную длину последовательности в электрофорезе. Я попробовал ПЦР со многими вариациями программы и различными другими изменениями и пришел к выводу, что с моими праймерами что-то не так. Я хотел бы обсудить детали проекта,

Последовательность генов, которую я хочу амплифицировать, состоит всего из 6 генов. Первые четыре гена — это aroB, aroA, cytC и moeA1 (Santini et al.2010). Эти гены находятся в одном генном кластере. Два других гена расположены выше по течению, это AroS и aroR. Эти два кластера генов составляют двухкомпонентную систему передачи сигнала, которая кодирует автотрофное окисление арсенита. В своей оригинальной публикации д-р Джоанн Сантини добавила ссылку на последовательность всех 6 генов в нуклеотиде NCBI. Я указал ссылку в предыдущем абзаце. Я зашел на компилятор генома Addgene и нашел точную последовательность из NCBI, и я вставил скриншот этого ниже. По какой-то причине настоящие гены, в амплификации которых я заинтересован, не начинаются в начале последовательности на NCBI. Вместо этого первый ген, aroS, начинается с 424-го нуклеотида. От нуклеотидов 1-423 компилятор генома указал это как «неизвестно». По этой причине я решил избавиться от этих нуклеотидов, и просто усилить остальную часть этого. То же самое произошло в конце последовательности, где последний ген, moeA1, остановился на нуклеотиде 8263. С тех пор компилятор генома перечислил остальные как «неизвестные». Я решил не заниматься неизвестными регионами, а просто амплифицировать интересующие меня гены.

Первый ген этой последовательности, aroS, начинается с ATGAGCCTTCTCGAGC . Я знаю, что для разработки праймеров прямой праймер должен соответствовать последовательности начала интересующего гена. По этой причине прямой праймер содержал ATGAGCCTTCTCGAGC . Поскольку я клонировал его в вектор, pBAD30 (карта указана здесь https://www.addgene.org/vector-database/1847/ ), я хотел добавить сайт ограничения в прямой праймер. Я обнаружил, что kpnI подойдет для моей последовательности. Последовательность kpnI — «GGTACC», поэтому я добавил ее в свой праймер. Букварь пока набирается так: GGTACC ATGAGCCTTCTCGAGC. Я также узнал, что последовательность сидения должна быть добавлена ​​в начало букваря, поэтому я произвольно добавила четыре буквы к началу «GTAT». После всех этих трех дополнений мой окончательный предварительный пример — GTATGGTACC ATGAGCCTTCTCGAGC . При проектировании обратной грунтовки я не совсем уверен в правильности своего дизайна. Последние 18 оснований последнего гена, moeA1, представляют собой GAACCGTTCGCAATGTGA . Я знал, что обратный праймер должен быть обратным дополнением, поэтому я обнаружил, что обратным дополнением будет TCACATTGCGAACGGTTC . Что касается моего сайта ограничений, я решил использовать xmaI. Последовательность для xmaI — «CCCGGG», поэтому я добавил эту последовательность в свой обратный праймер. Последовательность на данный момент такова: CCCGGG TCACATTGCGAACGGTTC. Как и в прошлый раз, я добавил базы «GATA» в качестве сидячей последовательности. Конечная последовательность обратного праймера представляет собой «GATACCCGGG TCACATTGCGAACGGTTC ».

После того, как я разработал оба праймера, я вставил эти последовательности в Integrated DNA Technologies и заказал праймеры в растворе (100 мМ с IDTE). В качестве набора для ПЦР я использовал dNTPack Expand Long Range от Millipore-Sigma. Этот набор для ПЦР включал ферменты, нуклеотиды и все буферы, необходимые для ПЦР.

После того, как праймеры были доставлены, я подготовил несколько мастер-миксов для ПЦР. Я следовал инструкциям производителя по настройке мастермиксов и программы ( https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Roche/Bulletin/1/elongnrobul.pdf). Температура плавления моего прямого праймера была 60,5°C, а температура плавления обратного праймера 64,4°C. Из-за этого я выбрал температуру отжига 57,5°C. Меня немного беспокоит разница в температуре плавления и влияние, которое она может оказать на отжиг, и теперь я понимаю, что могла бы отрегулировать содержание GC в обоих праймерах, чтобы получить более близкие температуры плавления. Однако я не думаю, что это является причиной отсутствия усиления. Одна проблема, которая меня беспокоит в отношении моих мастер-миксов, заключается в том, что я не знаю концентрацию ДНК в растворе очищенной плазмиды. Каждый матермикс должен содержать до 500 нг ДНК, но я использовал 1-8 мкл раствора ДНК в каждом мастермиксе. Может ли быть слишком много ДНК? Слишком мало? Я пробовал много разных вариантов, и ни один не работал. По большей части, каждая мастермикс использовала 3 мкл данного ДМСО. На моем 17-м прогоне ПЦР я получил какой-то результат. Как я упоминал ранее, я не возился с неизвестными областями ДНК, поэтому наша окончательная последовательность из 6 генов должна иметь длину около 7,8 килобаз. После ПЦР я прогнал его под гелем и вот что увидел:

На третьей дорожке полосы ДНК были самыми яркими. Удивительно, но для третьей дорожки я добавил колонию наших бактерий в мастермикс для источника ДНК, и получилась полоса. Большинство дорожек показывают полосу ДНК, но полосы не совсем в районе 7,8 т.п.н., так что я думаю, что это не наш желаемый продукт. Могло ли это быть нашим продуктом, но примеси замедляли движение ДНК? Если это так, я хотел бы знать, следует ли мне продолжать рестрикционное расщепление вставки и pBAD30, а затем лигирование.