Мне немного неловко спрашивать, но когда у вас есть, например, четыре вырожденных праймера, а конечный протокол говорит, что конечная концентрация праймера должна составлять 10 мкМ рабочего раствора, должны ли вы сделать праймеры общим объемом 10 мкМ (по 2,5 мкМ каждый) или 10 мкМ для каждый вырожденный праймер?
Вы можете просто добавить по 2 мкл каждого рабочего раствора (10 мкМ) к смеси для ПЦР из 20 мкл.
Вы можете проверить этот протокол.
Внимание : автор использовал
вместо
Он использует по 5 мкл каждого праймера (20 мкМ) на 50 мкл реакции. Это вдвое больше того, что я упомянул. ИМО, лучше попробовать с более низкой концентрацией, а затем увеличить ее при необходимости. Избыточная концентрация праймеров может привести к некоторому неспецифическому связыванию и амплификации, если праймеры не идеально сконструированы.
С этого сайта:
Использование вырожденных праймеров
Поскольку вырожденный праймер на самом деле представляет собой смесь разных праймеров, только часть вырожденного «праймера» будет работать в ПЦР. Следовательно, необходимо увеличить концентрацию праймера в ПЦР, реакциях секвенирования и т. д. Если праймер вырожден в 8 раз, концентрацию следует увеличить в 4–8 раз и т. д. Однако для более высоких вырождений, например, в 64 раза, нельзя увеличить концентрацию праймеров в 64 раза и придется попытать счастья только с 5-10-кратным увеличением.