Как предотвратить присоединение старого промотора к плазмиде вместо нового при лигировании?

Что я пытаюсь сделать, так это удалить существующую промоторную область в плазмиде и заменить ее новой. Итак, сначала я использую соответствующие ферменты рестрикции, чтобы избавиться от существующей промоторной области. Затем я добавляю новый фрагмент промотора, который имеет соответствующие липкие концы, а затем путем лигирования я хочу поместить новый промотор в плазмиду.

Поскольку старая промоторная область и новая промоторная область будут иметь одинаковые «липкие концы», как мне предотвратить размещение старой промоторной области в плазмиде вместо новой во время лигирования?

Выполнение лигирования и секвенирования 5-10 клонов является опцией. Вам нужен только один клон с «новым» промотором, который будет добавлен к лигированию в избытке, верно?

Ответы (1)

  1. Запустите его на геле после пищеварения и извлеките только вектор.

  2. Обработать фосфатазой после переваривания. Это предотвратит повторную лигацию, поскольку вам нужно, чтобы хотя бы один из ваших фрагментов был фосфорилирован, чтобы лигирование работало.

  3. (Независимо от того, что необходимо) упорядочить несколько колоний в конце.

Я рекомендую делать все три.

Изменить: вариант 4: переварить с помощью третьего фермента, который разрезает ваш старый промотор, но не вектор или новый промотор.

Если ваш новый промотор короткий и вы используете пару олигонуклеотидов с липкими концами, которые не нужно обрезать, вам следует либо фосфорилировать олигонуклеотиды с помощью полинуклеотидкиназы, либо не дефосфорилировать вектор. Вам нужно, чтобы тот или другой был фосфорилирован, чтобы лигирование заработало. Кроме того, сбор многих колоний является обязательным. Обычно я делаю 24 минипрепарата за раз, потому что столько помещается в центрифуге. Делайте столько, сколько сможете. Было много случаев, когда только 1 мини-подготовка была успешной. Говоря об этом, есть хороший способ скрининга, вам нужны хорошие четкие результаты.
Итак, чтобы подтвердить, как только я избавлюсь от старой промоторной области, прогоню ее на геле, чтобы выделить «открытую плазмиду без промоторной области». Как только у меня это получается, я предварительно формирую лигирование с новой промоторной областью....
На плазмиде у меня будет amp. устойчивый ген как способ отслеживания успешно трансформированных бактерий.
@RadekMartinez Да, вы описываете стандартную процедуру клонирования, вырезайте, вставляйте, проверяйте наличие хороших плазмид. Кто твой новый промоутер? Насколько он велик?
Я пока не уверен. Однако это не 20-30 бп, а гораздо больше.
Как предотвратить присоединение старого промотора к плазмиде вместо нового при лигировании?
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v