Количественная экспрессия генов

Что такое уровень экспрессии белка?

Это был первоначальный заголовок поста, который я отредактировал сам, потому что считаю ответ тривиальным, а вопрос более существенным. Чтобы сначала разобраться с тривиальным:

«Уровень» не является научной единицей и может однозначно использоваться только как научный термин в его английском смысле по отношению к жидкостям, например, «Уровень ртути в термометре упал», «Земля находится на высоте 10 метров над уровнем моря». уровень."

Он используется некоторыми людьми в неформальной устной или письменной речи для обозначения неопределенного количественного определения, и из-за его двусмысленности его настоятельно не рекомендуется использовать в научном общении.

Так что ни я, ни кто-либо другой не может сказать, что такое «уровень экспрессии белка», не выяснив, что имел в виду автор этой фразы (если он действительно знал) в каждом отдельном случае: количество или концентрацию белка или скорость его синтеза.

Количественное определение

Давайте рассмотрим некоторые общие аспекты клеточной молекулы, которые могут потребовать количественного определения : количество, скорость синтеза, скорость деградации и, при необходимости, биологическую активность.

Количественное определение молекул в его самом основном является числом видов или, более практично, их общей массой (граммы), где это возможно, относительно их молекулярной массы (т.е. молей). Скорость их синтеза или деградации выражается через изменение их количества в единицу времени.

Для сравнения различных систем необходим эталон для количественного определения. Это может быть на единицу объема, на клетку, на г клеточного белка, на г ДНК и т. Д. (Однако для сравнения подобных систем или внутри одной системы ссылка часто опускается.)

Биологическая активность молекул имеет смысл только в том случае, если молекулы действительно биологически активны (например, ферменты). Он выражается в единицах, связанных с этой деятельностью.

Примеры количественного определения белков

Фактические единицы, используемые в количественном анализе, определяются тем, как можно измерить интересующий параметр.

Относительное количество белка: белок можно определить по интенсивности окрашивания полосы на геле или по степени преципитации с использованием соответствующего антитела. Их необходимо откалибровать по стандартам, чтобы преобразовать необработанные экспериментальные измерения в г или молярный белок. Типичными единицами относительного количества являются г/г общего белка, г/г ДНК.

Скорость синтеза или деградации белка. Вы можете определить синтез белка по скорости включения радиоактивных аминокислот в нерадиоактивный белок и скорости деградации по высвобождению радиоактивных аминокислот из предварительно меченого белка. Типичными единицами синтеза могут быть мг аминокислот, включенных в минуту, на мг общего белка. (Это может быть преобразовано в молекулы, синтезированные или расщепленные в минуту, если это необходимо.)

«Активность белка» : использование этого термина не рекомендуется. С химической точки зрения активность молекулы является мерой ее «эффективной концентрации» , а по отношению к белкам это было бы предметом заботы только биофизиков и им подобных. Другие биологи связали бы этот термин с биологической активностью белка, такого как фермент, но, поскольку многие белки являются структурными, термин «активность» не может применяться к белкам в целом. Там, где это представляет интерес, его можно количественно определить с точки зрения характера активности, например, количество фермента определяется в единицах, связанных с количеством субстрата, превращенного в продукт в данный момент времени.

Количественная оценка экспрессии генов с использованием олигонуклеотидных микрочипов

Двумя крайностями в количественной оценке экспрессии генов являются подробное изучение экспрессии одного конкретного гена, кодирующего белок, для которого доступны информация и инструменты; и общее изучение экспрессии многих генов с использованием современных методов, позволяющих изучать множество молекул одновременно. Такие методы включали масс-спектрометрию (для небольших метаболитов), двумерный гель-электрофорез (для белков) и микрочипы или РНКсек (для мРНК). В общем, в последнем случае можно было бы исследовать влияние какого-либо агента или состояния на весь спектр экспрессии генов.

Давайте рассмотрим технологию микрочипов , так как это главная задача постера.

Технология микрочипов измеряет относительное количество мРНК.

Методология включает амплификацию смешанных видов мРНК путем обратной транскрипции в кДНК, которые метят флуоресцентным красителем. кДНК гибридизуют с иммобилизованными олигонуклеотидами на основе последовательностей генов в организме, и предполагается, что сила флуоресцентного сигнала пропорциональна количеству отдельных видов мРНК в образце. Однако данные, предоставляемые пользователю, представляют собой относительную интенсивность изображения в рамках эксперимента, а не единицы, которые позволяют рассчитать фактическое количество мРНК.

Как эти относительные количества мРНК связаны с экспрессией генов?

1. Относительные количества мРНК являются относительной мерой скорости синтеза белков (3 в цифрах), если предположить, что скорость синтеза каждого белка также пропорциональна количеству его мРНК (а в цифрах), которые было бы ограничением. Это разумное предположение в большинстве случаев, учитывая, что мРНК расщепляется быстрее, чем белок. (Они не являются мерой количества белка — b в цифре.)

2. Относительное количество мРНК не может быть принято в качестве меры скорости транскрипции мРНК из ее гена (1 на цифре) из-за относительно большего влияния деградации мРНК (2 на цифре) на концентрацию мРНК в стационарном состоянии. и тот факт, что разные мРНК имеют разные периоды полураспада.

Постскриптум к плакату

Я попытался сделать этот ответ общим, чтобы он был полезен большему количеству людей. Поскольку плакат не является биологом, ей все еще может быть трудно понять предысторию биологических экспериментов, в результате которых были получены данные, которые она анализирует.

Представляющая интерес биологическая система представляет собой экспрессию генов, которая охватывает всю серию событий от транскрипции генов до мРНК и их трансляции в белок. Предысторией этого является то, что есть некоторые гены, которые (почти) всегда экспрессируются, независимо от физиологических обстоятельств, потому что они необходимы для поддержания структуры и повседневных функций клетки. Это называется конститутивной экспрессией, примерами которой является экспрессия генов цитоскелетных актинов или рибосомных белков. Другие гены экспрессируются («включаются») только тогда, когда это необходимо (и их можно назвать индуцируемыми) .). Вопрос здесь, по-видимому, заключается в том, экспрессируются ли гены ферментов, участвующих в репарации ДНК, все время (конститутивно), чтобы иметь дело с нормальным «изнашиванием» ДНК, или же их экспрессия происходит только в ответ на какое-то повреждение, известное человеку. повреждение ДНК, например, гамма-облучение.

Как я упомянул как ученый-экспериментатор, один из подходов, который можно здесь применить, состоит в том, чтобы посмотреть на экспрессию одного или двух хорошо охарактеризованных белков, которые, как известно, участвуют в репарации ДНК. Однако в этом процессе могут участвовать белки, о которых вы не знаете, поэтому современные методы наблюдения за экспрессией всех генов в организме (если известна последовательность ДНК) — олигонуклеотидные микрочипы или, лучше, RNASeq. Эти методы измеряют относительное количество мРНК в клетке. Это не показатель количества белка или скорости его синтеза (термин «белковая активность» не имеет смысла, не используется и не должен использоваться), это то, что есть на самом деле , но это также отражение экспрессии генов.которые кодируют мРНК. Нет экспрессии, нет мРНК.

Вы можете думать о микрочипах и подходах RNASeq как о рыболовных экспедициях. Если вы обнаружите мРНК, которые присутствуют только после того, как клетка получила стимул или повреждение, значит, произошла экспрессия мРНК (независимо от того, прямо пропорционально количество или нет скорости синтеза). Если мРНК синтезируется, можно предположить, что она транслируется в белок, который она кодирует. В случае гамма-облучения вы могли бы предположить, что любая мРНК, которая показывает значительное увеличение количества, кодирует белок, участвующий в защите клетки от радиации. Это будет представлять научный интерес, особенно если это не то, что ожидалось.