Почему увеличение концентрации вектора не увеличивает эффективность трансформации бактерий?

Я читал какое-то старое описание протоколов трансформации бактериальных клеток.

В описании я прочитал, что трансформация лучше всего работает с небольшим количеством ДНК, и если мы увеличим количество используемой ДНК, количество клеток-трансформантов не увеличится пропорционально.

Я просто удивляюсь, почему, так как в моих глазах процесс поступления в клетку в основном связан с принципами диффузии, а значит, зависит от концентрации.

Если плазмид во много раз больше, чем клеток, увеличение их концентрации, когда клетки уже насыщены, не приведет к увеличению коэффициента трансформации.
Спасибо, но тогда это похоже на ферментативный кинетик. Итак, теоретически у меня будет повышенная трансформация при более высокой концентрации плазмиды до точки насыщения, которая, как я предполагаю, зависит от штамма, который я использую для трансформации?

Ответы (1)

Согласно протоколу преобразования Ханахана (одна из самых высоких опубликованных компетенций), преобразование 200 мкл будет содержать 1 × 10 8 − 1,7 × 10 8 клетки.

Предполагая, что используется плазмида pBR322 , 1 нг плазмиды преобразуется в 0,36 фмоль плазмиды, или 6 × 10 8 плазмидные копии.

Как мы можем ясно видеть, даже при очень малом количестве используемой ДНК на клетку приходится несколько плазмид. Поскольку считается, что трансформация опосредована каналами ДНК , массовое увеличение количества ДНК не будет в равной степени увеличивать эффективность трансформации после того, как все эти каналы будут насыщены.

Пример с клетками NEB Turbo DH5α , по- видимому, достаточно хорошо показывает, что, как только количество ДНК превышает 1 нг, эффективность трансформации резко падает.

введите описание изображения здесь

При этом, если количество доступных плазмид очень велико, нет причин избегать добавления более 1 нг ДНК, поскольку они не уменьшат общее количество колоний трансформации, а только эффективность.

Большое спасибо за ваш хороший ответ. Однако я думаю, что в приведенном вами примере будет доступно около 6 копий плазмиды на каждую клетку. Насколько я понимаю, могут быть сотни возможностей (например, каналы ДНК, электропоретические отверстия) для входа ДНК. Итак, теоретически, если мы создадим кривую насыщения, мы увидим, что количество трансформантов увеличивается с количеством добавляемой плазмиды. , по крайней мере в начале. Когда насыщение достигнуто, количество ДНК не влияет. Не имеет смысла с самого начала добавлять больше ДНК, чтобы получить более высокий трансформант?
@efrem Я не уверен, применима ли в этом случае кинетика Михаэлиса-Ментен (в смысле кривой насыщения) из-за сочетания множества различных способов проникновения плазмиды, но общая концепция насыщения канала все равно должна применяться.
Благодарность! Таким образом, эффективность падает, но количество трансформированных клеток увеличивается в геометрической прогрессии. Поэтому, если кто-то не ограничен в плане количества плазмиды и имеет клетки, которые не так хорошо трансформируются, было бы лучше увеличить количество плазмиды, чтобы получить большее количество трансформанта, хотя и с меньшей эффективностью.
@efrem Увеличение, в первую очередь, НЕ экспоненциальное. На самом деле это хуже, чем линейное, учитывая, что ось X логарифмическая, а ось Y линейная. Однако в большинстве случаев бактериальной трансформации вы в любом случае используете плазмиды высокой концентрации. Я не могу придумать способ уменьшить количество колоний полной трансформации, добавив слишком много ДНК.
правильно, извините. Он действительно линейный. Во всяком случае, мне кажется, что нет большого недостатка в добавлении слишком большого количества ДНК (плазмиды) с точки зрения общего числа трансформированных клеток.
Почему увеличение концентрации вектора не увеличивает эффективность трансформации бактерий?
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v