Ограничивает ли количество dNTP скорость для очень длинных продуктов ПЦР?

Я использую систему Q5 и провожу ПЦР с продуктом, который будет иметь окончательную длину около 9500 оснований. Я заметил, что продукт есть, но очень слабый. Праймер видимо закончился.

Итак, мой вопрос: могут ли dNTP ограничивать скорость в длительной реакции? То есть могут ли все dNTP быть израсходованы в первых циклах ПЦР и быть недоступными для последующих экспоненциальных раундов?

Кажется, у вас примерно в 1000 раз больше dNTP, чем количество праймера (200 мкМ по сравнению с 0,2 мкМ). Так что, может быть... или моя базовая химия отключена. Любой приоритет?

IIRC Q5 требует 0,5 мкМ каждого праймера, как указано в документации. В любом случае, почему бы просто не добавить больше dNTP, если вы подозреваете, что причина в нем?
Я делаю это сейчас. Но, как и все в биологии, я уверен, что есть последствия слишком большого добавления.
Добавьте элементы управления, если сомневаетесь
Да, это возможно. dNTP также могут разрушаться при высоких температурах. Поэтому их добавляют в избытке. Вы можете добавить больше, и пока вы не проводите ПЦР в реальном времени, не беспокойтесь слишком о смазанных/множественных полосах. Вы всегда можете сделать повторную ПЦР.
Добавление слишком большого количества dNTP может вызвать проблемы. Они связывают магний из реакционного буфера, поэтому, если вы собираетесь резко увеличить количество dNTP, вам придется снова оптимизировать реакцию для магния.

Ответы (1)

200 мкМ dNTP в 50 мкл реакционной смеси могут дать более 10 мкг ДНК, если все dNTP будут израсходованы независимо от длины продуктов ПЦР. Вы можете обнаружить всего 5 нг фрагментов ДНК с помощью обычного электрофореза с использованием EtBr. Вы, вероятно, могли видеть четкую полосу, когда загружали более 100 нг фрагмента ДНК. Поэтому меня не слишком беспокоит концентрация dNTP.

Чем длиннее продукты ПЦР, которые вы амплифицируете, тем сложнее их амплифицировать. Тогда у вас может не хватить эффективности для обнаружения продуктов ПЦР. Возможно, вы захотите попробовать более низкую температуру отжига, если вы не получаете неспецифических полос с некоторыми добавками, такими как ДМСО, бетаин и т. д., или без них, или используете более сильные ферменты. Также может быть полезна сенсорная ПЦР для эффективного получения определенных полос.

Когда вы увеличиваете концентрацию dNTP, эффекты Mg++ могут быть приглушены, потому что dNTP может хелатировать Mg++, как упомянул Крис в колонке комментариев.

Что вы подразумеваете под «более сильным ферментом»? Q5 является одной из (если не самой) лучших коммерчески доступных ДНК-полимераз.
Ой, извините, я пропустил эту часть... Конечно, Q5 - один из самых сильных. Но это не значит, что другие ферменты бесполезны. Тем не менее, у вас есть шанс получить больше ПЦР-фрагментов с помощью других ферментов, таких как праймстар.
Ограничивает ли количество dNTP скорость для очень длинных продуктов ПЦР?
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v