Определение типа ингибитора по KmKmK_m и VmaxVmaxV_{max}

Я думаю, что можно определить тип ингибирования по (начальной) кривой зависимости скорости от концентрации субстрата, но это сложно. Обычно это делается с помощью линейного преобразования уравнения Михаэлиса-Ментен, такого как график Лайнуивера-Берка .

Но вы правы: для обратимого ингибитора способ идентифицировать характер торможения (то есть определить, является ли обратимый ингибитор конкурентным, неконкурентным, смешанным или неконкурентным ) заключается в изучении изменений кинетических констант (обычно K _m и V _max , но см. ниже)

Прежде чем мы перейдем к тому, как это делается, есть несколько моментов, о которых нам нужно знать.

• Следующее относится только к обратимым ингибиторам. Необратимое ингибирование, такое как ингибирование ацетилхолинэстеразы нервно-паралитическим зарином , лечится по-разному . (Под «обратимым» просто подразумевается, что если ингибитор удалить, например, путем разбавления, ингибирование исчезнет). Кроме того, ингибиторы прочного связывания не рассматриваются.
• Следующее также относится только к односубстратным ферментам, которые подчиняются уравнению Михаэлиса-Ментен. (Но анализ можно без особого труда распространить и на многосубстратные ферменты).
• Нам нужно быть очень осторожными с термином «неконкурентный». Для разных людей это означает разные вещи. Кроме того, часто это наименее интересный паттерн торможения.
• При анализе паттернов ингибирования часто легче анализировать влияние на V _max и V _max /K _m (константа специфичности), чем на K _m и V _max . Причина этого в том, что Km представляет собой сложную кинетическую константу и (как показали Далзил и Фершт ) ее следует рассматривать как отношение Vmax _к константе специфичности (Vmax _/ Km ₎ . В этом отношении кинетики ферментов «напортачили», считая константу специфичности отношением максимальной скорости к константе Михаэлиса:это постоянная Михаэлиса, которая является отношением . Однако парадигма рассмотрения константы специфичности как V _max /K _m настолько укоренилась, что я буду придерживаться ее. Но «хитрость» при анализе паттернов торможения состоит в том, чтобы думать в терминах V _max и V _max /K _m .
• Многое из того, что следует далее, может быть также применено к обратимой активации, но я вообще не собираюсь вдаваться в подробности.

1. Паттерны обратимых ингибиторов

Теперь мы можем определить наши паттерны торможения, независимо от какого-либо механизма, который их вызывает , следующим образом:

• Конкурентный ингибитор не влияет на V _max , но снижает видимое значение V _max /K _m . Мы также можем сказать, используя термины старой школы, что конкурентный ингибитор не влияет на V _max , но увеличивает кажущееся значение K _m . Или, если мы собираемся «визуализировать» вещи с точки зрения графиков Лайнуивера-Берка (см. эту статью в Википедии ), мы можем сказать, что конкурентный ингибитор не влияет на V _max , но увеличивает видимое значение K _m /V _max

• Неконкурентный ингибитор снижает видимое значение V _max , но не влияет на V _max /K _m . Или, рассуждая с точки зрения обратных величин, неконкурентный ингибитор увеличивает кажущееся значение 1/V _max , но не влияет на K _m /V _max . Во многих смыслах «неконкурентоспособный» — очень плохой термин. Cornish-Bowden (2004) предлагает термин «каталитический ингибитор», а Laidler и Bunting используют термин «антиконкурентный» для описания этого типа торможения.

• Смешанный ингибитор уменьшает кажущееся значение V _max и уменьшает кажущееся значение V _max / K _m . Или, размышляя в терминах обратных величин, «смешанный» ингибитор увеличивает кажущееся значение 1/V _max и увеличивает кажущееся значение K _m /V _max .
• Неконкурентный ингибитор лучше всего рассматривать как частный случай смешанного торможения, когда кажущиеся значения Vmax _и Vmax _/ Km _{уменьшаются} в одинаковой степени . Из этого следует интересное следствие: поскольку константу Михаэлиса можно рассматривать как отношение этих двух кинетических констант, она остается неизменной при неконкурентном торможении . Но трудно представить реалистичный кинетический механизм, приводящий к такому типу поведения. Корниш-Боуден (2004, стр. 118-119) очень силен в этом вопросе (существует также четвертое издание этой замечательной книги).
• Теперь мы подошли к «сложному» моменту. Некоторые авторы, в частности Клиланд , не делают различий между «смешанным» и «неконкурентным» ингибированием , а вместо этого называют все случаи, когда и Vmax _, и Vmax _/ Km _{снижаются} , «неконкурентным ингибированием» . Нам нужно быть очень осторожными в этом вопросе. Как кто-то однажды сказал, кинетики ферментов предпочли бы использовать зубные щетки друг друга, а не номенклатуру друг друга.

Итак, мы имеем дело: два случая, которые «разграничивают» обратимое ингибирование, это когда изменяется только кажущаяся V _max (неконкурентное ингибирование) и когда изменяется только кажущаяся V _max /K _{m (константа специфичности) (конкурентное ингибирование).} «Смешанное» ингибирование - это когда кажущиеся значения обеих этих кинетических констант затрагиваются, а особый случай «смешанного» торможения - это когда кажущиеся значения обеих кинетических констант уменьшаются в одинаковой степени, что не приводит к изменению Михаэлиса. постоянный.

2. Обратимые ингибиторные механизмы.

До сих пор я ничего не говорил о механизмах, которые могли бы привести к возникновению этих паттернов торможения. Предварительные:

• В дальнейшем$K_m$постоянная Михаэлиса,$V_{max}$максимальная скорость,$s$концентрация субстрата,$i$– концентрация ингибитора, а$K_{i}$а также$K_{ii}$являются константами ингибирования. Оба$v$а также$v_i$относятся к начальной скорости.
• Паттерны ингибирования анализируют с использованием графика Лайнуивера-Берка . Это удобно, так как на таком графике (см. эту статью в Википедии) точка пересечения по оси Y равна$1$/$V_{max}$а наклон равен$K_m$/$V_{max}$. Изменения кажущейся стоимости$V_{max}$проявляются как эффект перехвата по оси Y и изменяются на константу специфичности ($V_{max}$/$K_m$) проявляются как наклонный эффект. Кроме того, точка пересечения оси x равна$-1$/$K_m$, так что изменения к видимому$K_m$значение или отсутствие такого изменения легко распознаются.
• График Лайнуивера -Берка — не единственное линейное преобразование уравнения Мичелиса-Ментен и даже не лучшее (см. здесь ) . Другими графиками являются график Хейнса-Вульфа и график Иди-Хофсти . Как однажды сказал кто-то другой, биохимики поклоняются алтарю прямой линии. Я использую график Лайнуивера-Берка, потому что, по крайней мере, ИМО, он наиболее интуитивно понятен.
• Следует иметь в виду, что многие кинетические механизмы могут вызывать паттерн торможения. Например, многие кинетические механизмы могут вызывать конкурентное ингибирование. Ниже приведены иллюстративные примеры.
• Все графики ниже (сгенерированные с помощью Mathematica ) были созданы с помощью$V_{max}$= 100 и$K_m$= 10. Когда требовалась только одна константа ингибирования ($K_i$), было установлено значение 100. Когда требовалось два, второй ($K_{ii}$) был установлен на 20 (Все «произвольные единицы»). Графики, конечно, очень легко генерировать, и их можно сделать с помощью многих программных приложений.

(а) Конкурентное ингибирование

Рассмотрим обратимое ингибирование односубстратного фермента по описанному выше механизму, когда и ингибитор, и субстрат конкурируют за «свободный» фермент.

Вывод закона скорости для этого механизма с использованием предположения о равновесии или стационарном состоянии приводит к уравнению следующего вида (хорошие выводы приведены в Segel , 1975):

$$v_{i} = { {{{V_{max}}}\ s\ }\over{K_{m}(1 + {i\over{K_{i}}})} + s}\ \ \ \ \ (1)$$

Репрезентативные графики уравнения (1), показывающие влияние увеличения концентрации ингибитора:

Обращение к уравнению (1) с последующей перестановкой приводит к линейному преобразованию Лайнуивера-Берка:

$${1\over{v_i}}=\frac{K_m}{V_{max}}(1 + {i\over{K_i}})( {1\over{s}}) + {1\over{V_{max}}}\ \ \ \ \ (2)$$

Сразу видно, что ингибитор увеличивает кажущееся значение$K_{m}$/$V_{max}$но не влияет 1 /$V_{max}$.

То есть это влияет на константу специфичности ($V_{max}$/$K_{m}$) но нет$V_{max}$. Таким образом, торможение носит конкурентный характер.

Графики уравнения (2) предсказывают семейство прямых линий, пересекающихся на оси y в точке$1$/$V_{max}$, и модель конкурентного ингибирования легко распознается:

С точки зрения преобразования Лайнуивера-Берка, конкурентный ингибитор вызывает увеличение наклона, но не изменяет точку пересечения по оси Y.

Мы также можем пойти дальше. Наклоны приведенных выше линий задаются следующим уравнением:

$$slope = \frac{K_m}{V_{max}} + \frac{K_m}{V_{max} K_{i}}{i}\ \ \ \ \ (3)$$

Таким образом , прогнозируется, что график зависимости наклона от концентрации ингибитора представляет собой прямую линию, которая пересекает ось x в точке -$K_i$

Такие повторы выполняют две функции. Во-первых, они позволяют определить$K_{i}$ценность. В этом случае точка пересечения по оси X равна -100, что не слишком удивительно, поскольку 100 было значением$K_i$выбранный в моделировании. Во-вторых, они проверяют неожиданную кинетическую сложность. Например, повторная диаграмма с изогнутым наклоном может указывать на частичное конкурентное ингибирование, когда комплекс EI может, возможно, разрушаться с образованием продукта. Такая кинетическая сложность, вероятно, редка для односубстратных ферментов, но может иметь место для многосубстратных ферментов (и может потребовать отказа от простого кинетического механизма в качестве объяснения кинетических данных). Segel (1975) очень силен в отношении частичного торможения и механизмов, которые могут его вызывать. Когда график наклона является линейным, мы можем говорить о линейном конкурентном ингибировании (см. Cornish-Bowden, 2004).

В отношении конкурентного ингибирования можно сделать ряд замечаний:

• Одним из «отличительных признаков» конкурентного ингибирования является то, что ингибирующий эффект можно преодолеть путем добавления избытка субстрата.
• Конкурентному ингибитору необязательно связываться с активным центром. Все, что требуется, это чтобы он связывался со свободным ферментом таким образом, чтобы предотвратить связывание субстрата . Например, аллостерический ингибитор может быть конкурентным. Но, конечно, конкуренция между субстратом и ингибитором за один и тот же активный центр является одним из способов возникновения конкурентного ингибирования (при условии, что связывание ингибитора предотвращает связывание субстрата). Segel (1975) очень силен в этом вопросе.
• Хорошим примером конкурентного ингибитора является малоновая кислота, которая ингибирует сукцинатдегидрогеназу (см. Segel, 1975). В мире кинетики двух субстратов пиразол является конкурентным по отношению к этанолу ингибитором алкогольдегидрогеназы печени лошади, и классическая статья (Ли и Теорелл), показывающая это, доступна здесь .

Наконец, давайте еще раз повторим этот момент: уравнение (1) описывает один механизм, порождающий паттерн конкурентного ингибирования . Это, конечно, не единственный.

(b) Неконкурентное ингибирование

Теперь давайте рассмотрим механизм, описанный диаграммой выше, где ингибитор не может связываться со «свободным» ферментом, а вместо этого связывается с комплексом фермент-субстрат (чтобы получить абортивный тройной комплекс EAI).

Вывод закона скорости его механизма (опять же, делая предположение либо об установившемся, либо о равновесии; см. Segel, 1975) приводит к уравнению следующего вида:

$$v_{i} = { {{{V_{max}}}\ s\ }\over{K_{m}} + (1 + {i\over{K_{i}}}) s}\ \ \ \ \ (3)$$

Трансформация в форму Лайнуивера-Берка :

$${1\over{v_i}}=\frac{K_m}{V_{max}}( {1\over{s}}) + {1\over{V_{max}}}(1 + {i\over{K_i}})\ \ \ \ \ (4)$$

В этом случае ингибитор увеличивает кажущуюся величину 1/$V_{max}$но не влияет$K_{m}$/$V_{max}$

Другими словами, это влияет на кажущуюся стоимость$V_{max}$, но не влияет на константу специфичности ($V_{max}$/$K_{m}$). Таким образом, ингибирование является неконкурентным .

Кроме того, в отличие от конкурентного ингибирования, увеличение концентрации субстрата не снимает ингибирование.

Неконкурентный ингибитор вызывает увеличение наклона графика Лайнуивера-Берка, но не изменяет точку пересечения оси Y на таком графике .

Поэтому дважды взаимные графики$1$/$v_i$ против $1$/$s$в разных$i$образуют семейство параллельных прямых .

В этом случае$K_{i}$может быть определено из повторного графика пересечения, где точка пересечения по оси x -$K_i$.

$$intercept={1\over{V_{max}}} +{i\over{V_{max} {K_i}}}\ \ \ \ \ (5)$$

(c) Смешанное ингибирование

Теперь давайте рассмотрим механизм, при котором ингибитор может связываться либо со «свободным» ферментом, либо с комплексом фермент-субстрат, и (для большей реалистичности) где субстрат может связываться либо со свободным ферментом, либо с комплексом фермент-ингибитор.

При некоторых упрощающих предположениях (см. Segel, 1975) показанный выше механизм может привести к следующему закону скоростей:

$$v_{i} = { {{{V_{max}}}\ s\ }\over{K_{m}(1 + {i\over{K_{i}}})} + (1 + {i\over{K_{ii}}}) s}\ \ \ \ \ (6)$$

В этом случае имеется две константы ингибирования, одна из которых «регулирует» связывание ингибитора со «свободным» ферментом ($K_{i}$) и один, «регулирующий» связывание ингибитора с фермент-субстратным комплексом ($K{ii}$).

С учетом обратных величин соответствующее преобразование Лайнуивера-Берка можно выразить следующим образом:

$${1\over{v_i}}=\frac{K_m}{V_{max}}(1 + {i\over{K_i}})( {1\over{s}}) + {1\over{V_{max}}}(1 + {i\over{K_{ii}}})\ \ \ \ \ (7)$$

Ингибитор увеличивает как кажущееся значение 1/$V_{max}$и (не обязательно одним и тем же фактором) и кажущееся значение$K_{m}$/$V_{max}$. Таким образом, торможение носит смешанный характер .

Уравнение (7) предсказывает семейство прямых, пересекающихся в одной точке:

$$({x, y})= (-\frac{K_{ii}}{K_i K_m}, \frac{K_{i} - K_{ii}}{K_i V_{max}}) = (-0.02,0.008) \ \ \ \ \ (8)$$

В этом случае повторные графики наклона и пересечения могут использоваться для определения значений$K_i$а также$K_{ii}$. Подробный анализ таких графиков дан в Segel (1975).

(d) Неконкурентное торможение

Теперь мы подошли к случаю неконкурентного торможения, которое (как указано выше) лучше всего рассматривать как частный случай смешанного торможения. Когда$K_i$знак равно$K_{ii}$, уравнение (6) упрощается до следующего:

$$v_{i} = { {{{V_{max}}}\ s\ }\over(1 + {i\over{K_{i}}})(K_{m} +s)}\ \ \ \ \ (9)$$

Преобразование Лайнуивера -Берка :

$${1\over{v_i}}=\frac{K_m}{V_{max}}(1 + {i\over{K_i}})( {1\over{s}}) + {1\over{V_{max}}}(1 + {i\over{K_{i}}})\ \ \ \ \ (10)$$

Уравнение (10) предсказывает семейство линий, где возрастание$i$влияет как на наклон, так и на точку пересечения в одинаковой степени, и которые пересекаются по оси x в точке$-1$/$K_m$

Но почему$K_i$равный$K_{ii}$в любом реальном случае?

Заметки

Фершт теперь владеет авторскими правами на свою книгу и распространяет ее бесплатно.

Все выпуски Acta Chem Scand (1947–1999), включая многие классические статьи, доступны в Интернете.

Пример вывода закона установившейся скорости приведен в этом ответе Biology Stack Exchange.

использованная литература

Кук, П.Ф. и Клеланд , В.В. (2007). Кинетика и механизм ферментов. Издательство Garland Science Publishing (Taylor & Francis Group). Лондон и Нью-Йорк.

Корниш-Боуден , А. (2004). Основы кинетики ферментов. 3-е изд. Портленд Пресс Лтд, Лондон.

Далзил, К. (1957). Начальные устойчивые скорости в оценке механизмов фермент-кофермент-субстратной реакции. Акта Хим. Сканд. 11, 1706 - 1723. [ pdf ]

Далзил, К. (1975). Кинетика и механизм никотинамид-нуклеотид-связанных дегидрогеназ. В The Enzymes, 3-е изд., Vol. 11. Бойер П.Д., изд. стр. 1–60. Academic Press, Нью-Йорк.

Фершт, А. (1999). Структура и механизм в науке о белках. Руководство по ферментативному катализу и сворачиванию белков. У. Х. Фриман, Нью-Йорк. [ pdf ]

Ли, Т. - К. и Теорелл, Х. (1969). Алкогольдегидрогеназа печени человека: ингибирование пиразолом и аналогами пиразола. Акта Хим. Сканд. 23, 892 - 902. [ pdf ]

Лайнуивер, Х. и Берк, Д. (1934). Определение констант диссоциации ферментов. Варенье. хим. соц . 56, 658 - 666.

Сегель , ИХ (1975). Кинетика ферментов. Поведение и анализ ферментных систем быстрого равновесия и устойчивого состояния. John Wiley & Sons, Inc., Нью-Йорк.

Конкурентный ингибитор конкурирует за активный центр. Следовательно, это будет препятствовать связыванию субстрата, тем самым увеличивая кажущуюся K _M .

Строго неконкурентный ингибитор не конкурирует за активный центр. Однако он ингибирует катализ, уменьшая количество доступных молекул активного фермента Е ₀ (если он является идеальным ингибитором), тем самым снижая V _max .

Также могут быть смешанные ингибиторы, и могут быть разные виды смешанного торможения. Например, ингибитор, который препятствует катализу и также может конкурировать за активный центр.

В зависимости от того, как вы определяете K _M , неконкурентный ингибитор может изменить или не изменить его. Если такой ингибитор может связываться с ферментом в неактивном центре и снижать его k _cat , он изменяет K _M , а также V _max в случае кинетики Бриггса-Холдейна .