По-видимому, можно определить, является ли ингибитор конкурентным или неконкурентным, по графикам концентрации субстрата (ось x) и скорости реакции (ось y).
Должна быть линия с ингибитором (постоянная концентрация) и без ингибитора. Разница в а также затем можно интерпретировать, чтобы выяснить, является ли ингибитор конкурентоспособным или нет.
Я знаю, что если действие ингибитора уменьшается с увеличением концентрации субстрата, то ингибитор является конкурентоспособным.
Однако я не понимаю, как определить по графикам, упомянутым ранее, и а также . Может кто-нибудь объяснить.
Я пытался найти это в Google, но большая часть того, что приходит, - это научные статьи, которые находятся за пределами моего понимания...
Я думаю, что можно определить тип ингибирования по (начальной) кривой зависимости скорости от концентрации субстрата, но это сложно. Обычно это делается с помощью линейного преобразования уравнения Михаэлиса-Ментен, такого как график Лайнуивера-Берка .
Но вы правы: для обратимого ингибитора способ идентифицировать характер торможения (то есть определить, является ли обратимый ингибитор конкурентным, неконкурентным, смешанным или неконкурентным ) заключается в изучении изменений кинетических констант (обычно K m и V max , но см. ниже)
Прежде чем мы перейдем к тому, как это делается, есть несколько моментов, о которых нам нужно знать.
1. Паттерны обратимых ингибиторов
Теперь мы можем определить наши паттерны торможения, независимо от какого-либо механизма, который их вызывает , следующим образом:
Конкурентный ингибитор не влияет на V max , но снижает видимое значение V max /K m . Мы также можем сказать, используя термины старой школы, что конкурентный ингибитор не влияет на V max , но увеличивает кажущееся значение K m . Или, если мы собираемся «визуализировать» вещи с точки зрения графиков Лайнуивера-Берка (см. эту статью в Википедии ), мы можем сказать, что конкурентный ингибитор не влияет на V max , но увеличивает видимое значение K m /V max
Неконкурентный ингибитор снижает видимое значение V max , но не влияет на V max /K m . Или, рассуждая с точки зрения обратных величин, неконкурентный ингибитор увеличивает кажущееся значение 1/V max , но не влияет на K m /V max . Во многих смыслах «неконкурентоспособный» — очень плохой термин. Cornish-Bowden (2004) предлагает термин «каталитический ингибитор», а Laidler и Bunting используют термин «антиконкурентный» для описания этого типа торможения.
Итак, мы имеем дело: два случая, которые «разграничивают» обратимое ингибирование, это когда изменяется только кажущаяся V max (неконкурентное ингибирование) и когда изменяется только кажущаяся V max /K m (константа специфичности) (конкурентное ингибирование). «Смешанное» ингибирование - это когда кажущиеся значения обеих этих кинетических констант затрагиваются, а особый случай «смешанного» торможения - это когда кажущиеся значения обеих кинетических констант уменьшаются в одинаковой степени, что не приводит к изменению Михаэлиса. постоянный.
2. Обратимые ингибиторные механизмы.
До сих пор я ничего не говорил о механизмах, которые могли бы привести к возникновению этих паттернов торможения. Предварительные:
(а) Конкурентное ингибирование
Рассмотрим обратимое ингибирование односубстратного фермента по описанному выше механизму, когда и ингибитор, и субстрат конкурируют за «свободный» фермент.
Вывод закона скорости для этого механизма с использованием предположения о равновесии или стационарном состоянии приводит к уравнению следующего вида (хорошие выводы приведены в Segel , 1975):
Репрезентативные графики уравнения (1), показывающие влияние увеличения концентрации ингибитора:
Обращение к уравнению (1) с последующей перестановкой приводит к линейному преобразованию Лайнуивера-Берка:
Сразу видно, что ингибитор увеличивает кажущееся значение / но не влияет 1 / .
То есть это влияет на константу специфичности ( / ) но нет . Таким образом, торможение носит конкурентный характер.
Графики уравнения (2) предсказывают семейство прямых линий, пересекающихся на оси y в точке / , и модель конкурентного ингибирования легко распознается:
С точки зрения преобразования Лайнуивера-Берка, конкурентный ингибитор вызывает увеличение наклона, но не изменяет точку пересечения по оси Y.
Мы также можем пойти дальше. Наклоны приведенных выше линий задаются следующим уравнением:
Таким образом , прогнозируется, что график зависимости наклона от концентрации ингибитора представляет собой прямую линию, которая пересекает ось x в точке -
Такие повторы выполняют две функции. Во-первых, они позволяют определить ценность. В этом случае точка пересечения по оси X равна -100, что не слишком удивительно, поскольку 100 было значением выбранный в моделировании. Во-вторых, они проверяют неожиданную кинетическую сложность. Например, повторная диаграмма с изогнутым наклоном может указывать на частичное конкурентное ингибирование, когда комплекс EI может, возможно, разрушаться с образованием продукта. Такая кинетическая сложность, вероятно, редка для односубстратных ферментов, но может иметь место для многосубстратных ферментов (и может потребовать отказа от простого кинетического механизма в качестве объяснения кинетических данных). Segel (1975) очень силен в отношении частичного торможения и механизмов, которые могут его вызывать. Когда график наклона является линейным, мы можем говорить о линейном конкурентном ингибировании (см. Cornish-Bowden, 2004).
В отношении конкурентного ингибирования можно сделать ряд замечаний:
Наконец, давайте еще раз повторим этот момент: уравнение (1) описывает один механизм, порождающий паттерн конкурентного ингибирования . Это, конечно, не единственный.
(b) Неконкурентное ингибирование
Теперь давайте рассмотрим механизм, описанный диаграммой выше, где ингибитор не может связываться со «свободным» ферментом, а вместо этого связывается с комплексом фермент-субстрат (чтобы получить абортивный тройной комплекс EAI).
Вывод закона скорости его механизма (опять же, делая предположение либо об установившемся, либо о равновесии; см. Segel, 1975) приводит к уравнению следующего вида:
Трансформация в форму Лайнуивера-Берка :
В этом случае ингибитор увеличивает кажущуюся величину 1/ но не влияет /
Другими словами, это влияет на кажущуюся стоимость , но не влияет на константу специфичности ( / ). Таким образом, ингибирование является неконкурентным .
Кроме того, в отличие от конкурентного ингибирования, увеличение концентрации субстрата не снимает ингибирование.
Неконкурентный ингибитор вызывает увеличение наклона графика Лайнуивера-Берка, но не изменяет точку пересечения оси Y на таком графике .
Поэтому дважды взаимные графики / против / в разных образуют семейство параллельных прямых .
В этом случае может быть определено из повторного графика пересечения, где точка пересечения по оси x - .
(c) Смешанное ингибирование
Теперь давайте рассмотрим механизм, при котором ингибитор может связываться либо со «свободным» ферментом, либо с комплексом фермент-субстрат, и (для большей реалистичности) где субстрат может связываться либо со свободным ферментом, либо с комплексом фермент-ингибитор.
При некоторых упрощающих предположениях (см. Segel, 1975) показанный выше механизм может привести к следующему закону скоростей:
В этом случае имеется две константы ингибирования, одна из которых «регулирует» связывание ингибитора со «свободным» ферментом ( ) и один, «регулирующий» связывание ингибитора с фермент-субстратным комплексом ( ).
С учетом обратных величин соответствующее преобразование Лайнуивера-Берка можно выразить следующим образом:
Ингибитор увеличивает как кажущееся значение 1/ и (не обязательно одним и тем же фактором) и кажущееся значение / . Таким образом, торможение носит смешанный характер .
Уравнение (7) предсказывает семейство прямых, пересекающихся в одной точке:
В этом случае повторные графики наклона и пересечения могут использоваться для определения значений а также . Подробный анализ таких графиков дан в Segel (1975).
(d) Неконкурентное торможение
Теперь мы подошли к случаю неконкурентного торможения, которое (как указано выше) лучше всего рассматривать как частный случай смешанного торможения. Когда знак равно , уравнение (6) упрощается до следующего:
Преобразование Лайнуивера -Берка :
Уравнение (10) предсказывает семейство линий, где возрастание влияет как на наклон, так и на точку пересечения в одинаковой степени, и которые пересекаются по оси x в точке /
Но почему равный в любом реальном случае?
Заметки
Фершт теперь владеет авторскими правами на свою книгу и распространяет ее бесплатно.
Все выпуски Acta Chem Scand (1947–1999), включая многие классические статьи, доступны в Интернете.
Пример вывода закона установившейся скорости приведен в этом ответе Biology Stack Exchange.
использованная литература
Кук, П.Ф. и Клеланд , В.В. (2007). Кинетика и механизм ферментов. Издательство Garland Science Publishing (Taylor & Francis Group). Лондон и Нью-Йорк.
Корниш-Боуден , А. (2004). Основы кинетики ферментов. 3-е изд. Портленд Пресс Лтд, Лондон.
Далзил, К. (1957). Начальные устойчивые скорости в оценке механизмов фермент-кофермент-субстратной реакции. Акта Хим. Сканд. 11, 1706 - 1723. [ pdf ]
Далзил, К. (1975). Кинетика и механизм никотинамид-нуклеотид-связанных дегидрогеназ. В The Enzymes, 3-е изд., Vol. 11. Бойер П.Д., изд. стр. 1–60. Academic Press, Нью-Йорк.
Фершт, А. (1999). Структура и механизм в науке о белках. Руководство по ферментативному катализу и сворачиванию белков. У. Х. Фриман, Нью-Йорк. [ pdf ]
Ли, Т. - К. и Теорелл, Х. (1969). Алкогольдегидрогеназа печени человека: ингибирование пиразолом и аналогами пиразола. Акта Хим. Сканд. 23, 892 - 902. [ pdf ]
Лайнуивер, Х. и Берк, Д. (1934). Определение констант диссоциации ферментов. Варенье. хим. соц . 56, 658 - 666.
Сегель , ИХ (1975). Кинетика ферментов. Поведение и анализ ферментных систем быстрого равновесия и устойчивого состояния. John Wiley & Sons, Inc., Нью-Йорк.
Конкурентный ингибитор конкурирует за активный центр. Следовательно, это будет препятствовать связыванию субстрата, тем самым увеличивая кажущуюся K M .
Строго неконкурентный ингибитор не конкурирует за активный центр. Однако он ингибирует катализ, уменьшая количество доступных молекул активного фермента Е 0 (если он является идеальным ингибитором), тем самым снижая V max .
Также могут быть смешанные ингибиторы, и могут быть разные виды смешанного торможения. Например, ингибитор, который препятствует катализу и также может конкурировать за активный центр.
В зависимости от того, как вы определяете K M , неконкурентный ингибитор может изменить или не изменить его. Если такой ингибитор может связываться с ферментом в неактивном центре и снижать его k cat , он изменяет K M , а также V max в случае кинетики Бриггса-Холдейна .
Дэйвид
Мирте