Сборка полимеразного цикла (PCA) не работает (только праймеры в геле EF)

Привет Всем 👋!

Я работаю, пытаясь собрать фрагменты двухцепочечной ДНК (для дальнейшего одомашнивания золотых ворот) с помощью сборки полимеразного цикла (PCA). После конструирования необходимых олигонуклеотидов с перекрывающимися областями. (Изображение конструкции представлено ниже). С использованием

NZYProof Green mastermix x2 25 мкл Внутренние олигонуклеотиды 2 мкл 1 мкМ запаса Внешние олигонуклеотиды 2 мкл 100 мкМ запаса

Начальная денатурация 95 ºC 2 мин Денатурация 95 ºC 30 с Отжиг 62 ºC 30 с Расширение 72 ºC 30 с Повторяется 25 циклами Окончательное удлинение 72 ºC 2 мин

Дизайн олинуклеотидов для реакции сборки PCA

После выполнения следующего протокола (на основе этого ) с полимеразной основной смесью высокой точности EF гель продуктов ПЦР показывает только одну «полосу», соответствующую олигонуклеотидам, введенным в реакцию. (Не обращайте внимания на размытый гель EF, он был виден через долгое время после запуска геля).

Гель ЭФ

Любая идея о том, что на самом деле может пойти не так? Разве я не должен наблюдать хотя бы несколько слабых более высокомолекулярных ампликонов?

Заранее спасибо за ваши ответы!

Хорхе.

ОБНОВЛЕНИЕ: Что касается длины перекрывающихся областей, в проекте учитывается различная длина перекрывающихся последовательностей, чтобы добиться примерно одинаковой Tm для всех перекрывающихся областей. Tm каждого перекрывания была рассчитана с помощью онлайн-инструмента NEB Tm Calculator, и все они находятся в диапазоне 61–63 °C (учитывая мастермикс Q5, который является самой близкой полимеразой HiFi к той, которую мы используем в настоящее время).

ОБНОВЛЕНИЕ 2: После попытки процедуры PCA с подходом «приземления» (постепенное снижение температуры отжига после 3 последовательных циклов) большинство сборок начали демонстрировать отчетливые полосы желаемой длины в геле EF. Отжиг является важным параметром для PCA.

Я только что прогнал последовательность перекрытия красных/право-серых праймеров (gtgaggacgaaacagcctctacaaataatt) через калькулятор NEB Tm по адресу tmcalculator.neb.com/#!/main и получил прогнозируемую Tm 68C.
Да! Это действительно так. Предоставленное изображение является единственной сборкой PCA, в которой наблюдается странное перекрытие более высоких Tm. Однако остальные (две другие дорожки геля EF) представляют собой другие последовательности, в которых все перекрывающиеся области имеют температуру плавления от 61 до 62 ºC.

Ответы (1)

Я подозреваю неправильное заполнение из-за слишком низкой температуры отжига по сравнению с прогнозируемой температурой плавления областей перекрытия. Как отмечает протокол в вашей ссылке:

(3) Грамотно выбирайте температуру отжига. Мы рекомендуем использовать то же, что и min_Tm в дизайне Primerize, который обычно составляет 60–64 °C.

(4) Проверьте продукт ПЦР на 4% агарозном геле. Если сборка с более короткими изделиями с неправильной заливкой не удалась, мы предлагаем попробовать повысить температуру отжига, чтобы уменьшить неправильную заливку. В качестве альтернативы можно разделить сборку на отдельные субпулы (т.е. праймеры 1-4 и праймеры 5-6) и провести дополнительный раунд полной сборки (см. ниже).

На первый взгляд, образец сборки в связанном протоколе использует области перекрытия одинаковой длины (предположительно, с одинаковой прогнозируемой температурой плавления), в то время как ваши перекрытия существенно различаются по длине (особенно красная грунтовка и серая грунтовка внизу справа).

Используя страницу калькулятора NEB Tm (tmcalculator.neb.com/#!/main), я получил следующие предсказанные Tms:

последовательность перекрытия левого серого/красного праймера (ctttccggtctgatgagt) Tm 61C

перекрывающаяся последовательность красного/правого серого праймера (gtgaggacgaaacagcctctacaaataatt) Tm 68C

последовательность перекрывания зеленого/левого серого праймера (gctcgtataatgtgtggaag) Tm 60C

Основываясь на гораздо более высокой Tm перекрытия красного / правого серого, я бы повторил вашу реакцию с температурами отжига 65C и 68C.

Спасибо за совет, Арманд, мы попробуем сделать так и проверим результат. Однако для нас по-прежнему странно не найти какого-либо другого продукта более высокой молекулярной массы, чем сами праймеры.
Может быть более общая проблема с вашей реакцией ПЦР. Может быть полезно провести положительную контрольную реакцию там, где вы проводите традиционную ПЦР, с двумя праймерами, амплифицирующими сегмент из матрицы. Связанный протокол также предлагал разбить реакцию на сегменты с двумя праймерами, а затем провести окончательную реакцию для сборки этих перекрывающихся сегментов. Я согласен с тем, что если вы не видите продуктов ни на одной из ваших полос реакции, это говорит о том, что проблема не только в одной последовательности.
В прошлом у меня был опыт работы с неочищенными препаратами праймеров, которые ингибировали реакцию, производили остатки в лунках, которые ингибировали реакцию, и так далее. Положительные контрольные реакции, которые позволяют убедиться, что все компоненты реакции и условия работают, могут помочь быстрее устранять неполадки.
На самом деле, мы уже пытались проводить другие ПЦР-амплификации, и эти реакции были успешными. Кажется, что это не проблема смеси для ПЦР или примесей в пробирках. Мы также выполнили «PCA» только с двумя перекрывающимися праймерами, и результаты были аналогичны опубликованным здесь. Я начинаю думать, что наш буфер HiFi Polymerase приводит к более низким температурам плавления по сравнению с NEB Q5 (ближе к полимеразам Phusion), поэтому, возможно, попытка с Toucdown PCA может быть оправдана.
Также может быть, что разрешение геля EF недостаточно, и «размытое пятно» представляет собой несколько полос. Мы попробуем снова запустить продукты на хорошо работающем 4% агарозном геле и посмотрим на результаты. Мы также планируем провести вторую ПЦР только с внешними праймерами, используя прежний продукт ПЦР в качестве матрицы, и посмотреть, произойдет ли какая-либо амплификация. Мы будем держать эту тему в курсе. Спасибо за все мудрые советы Арман!
Кажется, у вас все получилось — удачи! Я знаю, как это может быть неприятно, когда предположительно простая реакция не работает.
Сборка полимеразного цикла (PCA) не работает (только праймеры в геле EF)
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v