Разделение более мелких фрагментов ДНК и более крупных фрагментов без использования гель-электрофореза?

Одним из вариантов является использование шариков SPRI, подобных тем, что продаются компанией Ampure ( шарики Ampure XP ), для разделения фрагментов ДНК по размеру. Регулируя соотношение шариков к образцу, вы можете выборочно связывать фрагменты определенной длины, исключая фрагменты другой длины, как показано на следующем изображении:

На этом изображении вы можете попробовать использовать соотношение гранул к образцу, равное 0,7, чтобы исключить фрагменты ниже 200 п.н., или соотношение от 0,7 до 0,6, чтобы исключить только фрагменты ниже где-то между 200 и 250 п.н. Преимущество шариков перед гелем заключается во времени, которое требуется. Выбор размера гранулами занимает всего около 10 минут по сравнению с 30 или более минутами для геля (включая экстракцию).

Как и в случае любой процедуры молекулярной биологии, важно протестировать ее и убедиться, что она работает для вас. Например, может быть хорошей идеей взять аликвоты ваших образцов и сравнить длины и выходы, которые вы получаете от диапазона концентраций шариков, и/или сравнить выходы, которые вы получаете при использовании геля и (в данном случае) шариков. .

На мой взгляд, разделение гелем (использование геля с довольно высоким процентным содержанием для максимального разделения полос) и ручное иссечение, безусловно, являются лучшим вариантом. Проблема с фильтрами с отсечкой по молекулярной массе заключается в том, что значение, которое они дают (например, 5000 Да), является средним размером пор, а не точным. Таким образом, любая попытка отделить олигонуклеотиды длиной 270 п.н. от олигонуклеотидов длиной 170 п.н. приведет к тому, что часть более короткой конструкции попадет в конечный продукт, а часть более длинной последовательности попадет в поток. Шансы найти готовый продукт, который точно соответствует вашим требованиям по размеру, также невелики. Используйте эти типы наборов только в том случае, если вы, например, отделяете продукт ПЦР размером 300 п.н. от неиспользованных праймеров.

Вы можете провести своего рода колоночную хроматографию с использованием эксклюзионной матрицы, но это, по сути, то же самое, что и использование геля. Единственным преимуществом является то, что его можно масштабировать, поэтому, если вам нужно разделить большое количество продукта ПЦР (скажем, 5 или 10 мл), будет проще запустить одну колонку, чем загружать столько дорожек в гель.